1.1Современные возможности использования криоконсервированных ооцитов в программах ВРТ, методы криоконсервации ооцитов
Несмотря на достигнутые успехи в области применения программ ВРТ, эффективность их остается в пределах 35 - 40%, поэтому, на сегодняшний день, вопросы поиска путей улучшения результатов и совершенствования этих программ являются весьма актуальными.
Стремительное развитие современных криотехнологий повлекло за собой появление новых методов криоконсервации, одним их которых является метод витрификации. Благодаря появлению данного метода стало возможным использовать его для сохранения различного биологического материала с высокими показателями выживаемости.Решение целого ряда проблем, которыми сегодня приходится заниматься клиникам и центрам ЭКО, не представляется возможным без использования методов криоконсервации.
Идея сохранения и использования гамет возникла достаточно давно, о чем свидетельствуют первые сообщения, появившиеся еще в 18 веке - итальянский естествоиспытатель L. Spallanzani в 1776г. исследовал влияние низких температур на половые клетки.
Замораживание и хранение ооцитов человека является важной составляющей частью программ по лечению бесплодия. Как указывает литература, благодаря протоколам медленного замораживания с использованием криопротектора ДМСО, в середине 80-х годов прошлого века были получены первые беременности после оплодотворения in vitro размороженных ооцитов человека [69,70], тогда же были осуществлены и первые попытки их витрификации. В 1986 году Trounson впервые использовал метод витрификации для криоконсервации ооцитов человека. Выживаемость и частота оплодотворения составили 62% и 40% соответственно [234]. Тем не менее, значительные усилия, предпринимаемые исследователями в этой области, долгое время не сопровождались клинически значимыми результатами - не более 1 -2% размороженных ооцитов были в состоянии реализовать развитие эмбриона. Выживаемость и жизнеспособность зрелых ооцитов после размораживания составляла не более 60-75% [108,172].
Такая низкая выживаемость ооцитов обусловлена их некоторыми особенностями, а именно, - размерами, чувствительностью и нестабильностью мембран, а также цитоплазматических структур. Кроме того, долгое время необходимость использования высоких концентраций криопротекторов, которые оказывали токсическое воздействие на ооцит и могли вызвать осмотическое повреждение яйцеклетки, ограничивали возможности использования технологии витрификации ооцитов [108,172,36]. Одним из самых важных аспектов криоконсервации ооцитов и эмбрионов является минимизация повреждений, вызываемых формированием кристаллов льда, что достигается дегидратацией клетки до и в течение всего процесса замораживания. В связи с этим поиск новых подходов к адекватной дегидратации клетки явился первостепенной задачей в области криоконсервации яйцеклеток [16,17].Настоящим прорывом в области криоконсервации ооцитов явились работы Kuwayama, который является основоположником современной технологии витрификации биологического материала и ооцитов, в частности. По данным этой группы ученых, выживаемость ооцитов может достигать 100% [151,152,153]. Это стало возможным благодаря внедрению новейших технологий витрификации (Cryotop, Cryotip и т.д), которые позволили не только снизить концентрацию криопротекторов, но и уменьшить объем, что в значительной степени увеличило эффективность технологии витрификации.
Следует отметить, что метод витрификации является одним из сложных способов криоконсервации биологического материала. В основе метода витрификации лежит ультрабыстрая технология охлаждения, в результате которой удается избежать образования кристаллов льда, повреждающих клетку. В ходе процедуры биологический материал подвергается воздействию более высоких, по сравнению с методом медленного замораживания, концентраций криопротекторов, а затем погружается в жидкий азот. Как указано в литературных источниках, выживаемость, например, витрифицированных эмбрионов на стадии 2 пронуклеусов колеблется в пределах 81-93% (Park et al, 2000) [8,133,192].
Технология криоконсервации эмбрионов методом витрификации уже стала рутинной, в отличие от криоконсервации ооцитов, которая долгие годы, представляла большие трудности.Процесс витрификации ооцитов имеет определенные особенности, которые связаны с рядом цитологических и молекулярно-биохимических особенностей ооцита. Яйцеклетка - одна из крупнейших клеток
человеческого организма, содержит большое количество воды и состоит из: зоны пеллюцида, гликопротеиновой оболочки, ооплазмы и ядра, органелл (митохондрии, эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи), имеет диаметр 120-150 мкм. Следует отметить, что не все яйцеклетки подвергают витрификации. Для криоконсервации пригодны только ооциты, находящиеся на стадии метафазы II деления, которая характеризуется наличием активного аппарата веретена деления [91,92,93,163,194]. Веретено деления ооцита крайне чувствительно к воздействию низких температур. При снижении температуры происходит стремительная деполимеризация микротрубочек, что может привести к неправильной сборке веретена после размораживания и, как следствие, к нарушению расхождения хромосом при делении яйцеклетки после размораживания [44,91,93,166,167,168]. Указанные проблемы в той или иной степени были успешно разрешены в результате применения для криоконсервации ооцитов метода витрификации, который практически полностью исключает формирование кристаллов льда, так как происходит быстрый переход вещества в аморфное состояние и сводит к минимуму механическое повреждение клеток [70,135,235]. Следует отметить, что первоначально разработанные протоколы витрификации ооцитов, как отмечено в литературных источниках, были с высокой концентрацией криопротекторов и длительный период обладали выраженной цитотоксичностью, вызывая значимый осмотический стресс клетки [238]. Однако новым этапом в усовершенствовании метода витрификации стало увеличение числа криопротекторов в составе сред витрификации. Примером наиболее успешного использования трехкомпонентного состава
витрификационных сред (этиленгликоль, ДМСО, сахароза) стал Cryotop метод [152]. Также преимуществом современной техники витрификации является то, что криоконсервация происходит при большой скорости замораживания >20000^мин, с использованием более низких концентраций криопротекторов, чем ранее. Такая высокая скорость витрификации достигается благодаря объёму витрификационного раствора