Эмбриологический этап - оценка качества ооцитов в программах ВРТ

Так как основным результатом и показателем успешно проведенного протокола овариальной стимуляции, как у доноров ооцитов, так и у онкологических больных является получение качественных яйцеклеток, оценка полученных клеток производится в соответствии с разработанными стандартами.

Ооциты оценивают с помощью микроскопа или современного аппарата поляризационной микроскопии «Oosight».

Биологические характеристики ооцита, которые влияют на эффективность проведения различных программ ЭКО/ИКСИ это:

• Зрелость ооцитов

• Наличие веретена деления

• Цитоплазматические характеристики

• Вакуоли

• SER (скопление эндоплазматического ретикулума).

По данным T. Ebner, которые были представлены на ESHRE 2006г., развитие ооцитов хорошего качества находится в строгой зависимости от следующих факторов:

• Протокол КОС

• Качество фолликула (процесс апоптоза)

• На морфологическую характеристику ооцитов влияют зрелость ядра и цитоплазмы

Потенциально негативное влияние может оказывать скопление эндоплазматического ретикулума, вакуолизация, плотная центральная грануляция и отсутствие веретена деления.

Ооциты обычно окружены различным количеством клеток яйценосного бугорка, а если они очень зрелые, могут быть бледными и трудно различимыми.

Следует отметить, что витрификации подвергают только ооциты хорошего качества, которые находятся на стадии метафазы II деления. Метафаза II - преовуляторная фаза (ооциты получены из граафова пузырька): этот уровень созревания подходит для успешного оплодотворения. Клетки лучистого венца все еще окружают ооцит, но уже не имеют радиальной структуры, одно полярное тельце уже выделено [19,65,66,247].

Подробное морфологическое исследование зрелости ооцита является достаточно субъективным, велик риск неточностей, поэтому в клинике «АВА-ПЕТЕР» используют современнейший аппарат поляризационной микроскопии “Oosight” (рисунок 2).

Рисунок 2 - Характеристика ооцитов с помощью аппарата Oosight Следует отметить, что, по данным, Van Blerkom и Henry, 1992 морфологические аномалии ооцитов человека наблюдаются часто и выявляются у 13% ооцитов, оставшихся неоплодотворенными после процедуры ЭКО.

• внешний вид кумулюса,

• зрелость ядра,

• внешний вид первого полярного тельца,

• наличие мейотического веретена деления,

• размер ооцита,

• характеристики цитоплазмы — грануляция,

• вакуоли,

• гладкий эндоплазматический ретикулум,

• липофусциновые тельца,

экстрацитоплазматические характеристики — форма и цвет ооцитов, внешний вид перивителлинового пространства и прозрачной оболочки [237,55].

Оценка характеристик кумулюса очень важна для определения степени зрелости ооцита. С этой целью необходимо обратить особое внимание на три компонента: количество слоев кумулюса, степень экспансии его и контакт между клетками кумулюса и ооцита. В зависимости от количества слоев кумулюса выделяют следующие группы: менее трех слоев, от четырех до девяти слоев, более десяти слоев. Существуют следующие типы экспансии кумулюса: без экспансии или компактный кумулюс, экспансия клеток кумулюса, высокая степень экспансии. Контакт кумулюса с ооцитом — клетки кумулюса могут окружать ооцит полностью, частично, или не окружать вовсе, оставляя его непокрытым. Наилучшей комбинацией, которая соответствует зрелости кумулюса, является наличие более чем трех слоев, полностью окружающих ооцит, клеток кумулюса с экспансией. В литературе ранее указывали, что зрелость кумулюса положительно коррелирует со зрелостью ядер ооцитов и частотой оплодотворения, частотой формирования бластоцист и частотой наступления беременности. Однако сообщалось и о наличии различной степени асинхронии между зрелостью ядер ооцитов и зрелостью кумулюса, а противоречивые результаты в отношении частоты оплодотворения, доли развивающихся эмбрионов и частоты наступления беременности ослабляют вышеописанную гипотезу (Balaban и Urman, 2006). По данным литературы, чаще всего некоторая часть (~15 %) ооцитов, полученных при индукции овуляции, является незрелой: 4 % находятся на стадии метафазы первого мейотического деления (MI) и 11 % — все еще на стадии профазы первого мейотического деления, то есть на стадии зародышевого пузырька (GV) (De Vos и соавт., 1999). Зрелость ядер ооцитов можно легко определить по наличию первого полярного тельца.

Оценка морфологии первого полярного тельца, а именно его фрагментации, может использоваться для определения постовуляторного возраста ооцита. По данным литературы, наличие фрагментированных полярных телец сопровождается худшим качеством эмбриона и меньшей частотой оплодотворения, формирования бластоцисты, имплантации и наступления беременности, чем при наличии интактных полярных телец (Ebner и соавт., 1999; Ebner и соавт., 2000; Balaban и соавт., 2001; Ebner и соавт., 2002). Однако, так как продолжительность существования первого полярного тельца весьма небольшая, его морфология изменяется через несколько часов культивирования in vitro. Но по данным Verlinsky и соавт., 2003; Ciotti и соавт., 2004; De Santis и соавт., 2005, оценка морфологии полярного тельца не может служить надежным маркером качества ооцита и его способности к оплодотворению, по этой причине, вопрос о том, можно ли использовать морфологию полярного тельца для оценки качества ооцита, остается спорным.

Веретено деления образуется из микротрубочек, которые выстраиваются в определенном порядке с точками присоединения с обеих сторон ооцита (биполярно), к которым прикрепляются хромосомы. В норме веретено деления обладает свойством двойного лучепреломления. В зрелых ооцитах веретено должно находиться в месте выделения первого полярного тельца. Повреждение мейотического веретена деления, изменение его местоположения или отсутствие веретена деления может привести к нарушению расхождения хромосом и, как следствие, к анеуплоидии, гибели клеток, снижению частоты оплодотворения и формирования бластоцист (Hardarson и соавт., 2000; EichenlaubRitter и соавт., 2002; Wang и соавт., 2001; Rienzi и соавт., 2003).

Таким образом, определяющими характеристиками способности ооцита к развитию являются зрелость ядра, внешний вид веретена деления, размер ооцита и свойства его цитоплазмы.

Учитывая выше сказанное, не только количество, но и качество ооцитов, полученных в результате КОС и пункции фолликулов, является важной составляющей успеха различных программ с использованием витрифицированных ооцитов.

1.7