Генетические методы исследования - генотипирование по генам кандидатам
Генотипирование выполнялось в лаборатории экологической генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки, институте общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук.
(директор ИОГен РАН — член-корр. РАН, д.б.н., проф. Янковский Н.К.), заведующий лабораторией экологической генетики - д.б.н. Рубанович А.В.). Образцы крови собирали в вакутейнеры, содержащие ЭДТА, и хранили при -20-80°С до выделения ДНК. Для генотипирования мы выделяли ДНК из цельной крови с помощью наборов Diatom DNA Prep 200, основанных на использовании гуанидинтиоционата и Nucleus-сорбента (Isogene Lab.Ltd, Россия). Для проведения ПЦР реакции использовали лиофилизированные готовые наборы Master Mix (Фирма Изоген), в которые добавляли 10 мкл ПЦР-растворителя (Фирма Изоген), 3 мкл праймеров (оптическая плотность 3-4 о.е.), 2 мкл деионизованной воды, 5 мкл исследуемой ДНК.Амплификацию проводили в амплификаторе Applied Biosystems 9700 (GeneAmp® PCR System 9700). Визуализацию результатов осуществляли в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Праймеры и условия амплификации представлены в приложении 3.
Выбор сайтов для генотипирования был основан на использовании ресурса HaploView (version 4.2) для подбора таргетных SNP с целью покрытия всего гена. На рисунке 2.3.1 показана гаплотипическая структура гена FBLN5 (алгоритм Solid Spine). Таргетные SNP из каждого блока сцепления были выбраны для генотипирования. Дополнительно были изучены полиморфные сайты, отобранные по литературным данным
(rs929608 и rs2430347). На рисунке 2.3.2 показана гаплотипическая структура гена LOXL1 (алгоритм Solid Spine); дополнительно к двум таргетным SNP в каждом из двух блоков сцепления для генотипирования по литературным данным был отобран еще один SNP (rs3825942).
сэ свес
Г* W***
'AAE, Z Tt IlCACCAfiiEl' .ASA . ■ WPTLiAES .SAfi.TS ДI TKtAGfi №■ Ш. ■. WtttCACfi ... AAA
fisc .!ISfi
Wstitttm:'; LtiAKTCi: ■
.StTAllltli .: п- TCTtrtTi DlL h TCKCtCt - — CATCTtn W ІЙІ.ТЯІ ..
'SlAt —UAturStAAAE —MttEEtlAtTSftSlCAt -
'StEt r*-E 5 SE ГА: >А ESE E . WAKAELlAClArCEtEAC -
■A'Ct WtAttEtTAtSCt . .I-IAIIAtttcttAttStCИ . -I
.-StAt . -V-AAAtTAliASAAt . LtATtAAtlATTSTtttAAt L
SiCT ..VctASTATt-CAAAC I- CATAACtlATTSTTttCAt -Г
SiCt ■ И CSCC Cd A CSC C —!AKCAttttTATtitCAt I
■ACfit .Сі:L 'MATtAAtTATTStTttfiAtTiS
Ш .CAKAfitlACTATCElfiAtiI;;
CATtAEtlCCTATtfitCAt CIi CAlAACttCtlAtCfitCAt ..
U
JS
Рис. 2.3.1. Г аплотипическая структура гена FBLN5
NKIClrtNOOOINroein NMOlQKiei/l
ооооооаиннн «Н «Н «Н CS CS (N (N
CCCGAGGTGGA .376,-—СССТСАС .226 CTCCGGGCAAG .303WrTCCCTTT .397 TCTCGAACGAG .188-4ДСТТСТАТ .312 CTCCGGGCGAG .098/ VСТСТТАТ .026 CTCCGGGCGGG .026сCCTTAT .039 ,87
Рис.2.3.2. Гаплотипическая структура гена LOXL1
2.4