Иммуногистохимические методы исследования.

Иммуногистохимическое исследование выполнено на парафиновых срезах ткани опухолей яичников с помощью биотинстрептавидинового иммунопероксидазного метода с моноклональными антителами к фактору роста эндотелия сосудов (VEGF) и его рецептору VEGF-R2.

Для всех использованных в исследовании антител применяли одинаковую

схему постановки иммуногистохимической реакции.

Образцы тканей фиксировали в 10% забуференном формалине в течение

48 час. Проводку материала осуществляли в автоматическом режиме в вакуумном процессоре «Axcelsior» («Termo Scientific», США). После гистологической проводки материал заливали в парафин и затем готовили срезы толщиной 3-4 мкм. Для работы с образцами опухолевых тканей применяли специальные высокоадгезивные стекла фирмы «Дако».

Для работы со срезами опухолей яичников использовали модуль предподготовки PT-Link («Дако», Дания), позволяющий одновременно проводить депарафинизацию, регидратацию срезов, а также демаскировку антигенов. Этапы блокирования эндогенной пероксидазы, инкубация с первичными антителами, визуализирующим реагентом и раствором хромогена проводили на стейнере «Autostainer Plus Link» («Дако», Дания). Докрашивание срезов гематоксилином, заключение в бальзам или синтетическую среду проводили по общепринятой методике.

Демаскировку антигенов в опухолях яичников проводили при температуре 95^оС 20 минут в автоклаве. Стекла извлекали и охлаждали в буфере до комнатной температуры, обрабатывали промывочным буфером, дальнейшие этапы исследования выполняли согласно общепринятой схемы (Г.А.Франк и соавт., 2009). Ингибирование активности эндогенной пероксидазы проводили при помощи нанесения блокирующего раствора перекиси водорода с последующей инкубацией и промывкой в буфере.

Инкубацию с первичными антителами проводили в течение 30 минут с последующей промывкой срезов. Инкубацию с визуализирующим раствором

«En Vision» проводили при комнатной температуре в течение 30 минут с последующей обработкой промывочным буфером.

Оценку реакции в клетках первичных злокачественных опухолей яичников, в отдаленных метастазах, а также в рецидивах проводили полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антиген-позитивных клеток. Иммуногистохимическую реакцию оценивали как негативную («-» - нет реакции), слабоположительную положительную («+» - 10% клеток средней интенсивности окраски) и сильнопозитивную («+++» -

>10% клеток высокой интенсивности окраски).

Для каждого антигена оценивали тип специфического окрашивания, который зависел от локализации продукта реакции в клетке (цитоплазматический, мембранный, ядерный, смешанный).

Для VEGF и VEGF-R2 оценивали интенсивность цитоплазматической реакции и количество окрашенных клеток. Оценку реакции в клетках опухолей яичников проводили полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антиген позитивных клеток. Иммуногистохимическая реакция расценивалась как негативная («-» нет реакции) и позитивная («+» реакция средней и высокой степени интенсивности). Слабую степень выраженности клеточной реакции, а также реакцию стромы в исследование не включали. Результаты реакций с антигенами выражали в процентах с учетом количества окрашенных клеток на 100 учтенных опухолевых клеток в 5 репрезентативных полях зрения, при этом учитывали только среднюю и высокую степени интенсивности окрашивания компонентов опухолевой клетки.