I.4. ИММУНОМОДУЛИРУЮЩАЯ РОЛЬ И ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ АУТОАНТИТЕЛ

Иммунитет - способ сохранения гомеостаза, защитно - приспособительная реакция организма, сформировавшаяся в процессе эволюции и направленная на распознавание «своего» и «чужого», а также удаление «чужого» из организма [19, 26, 60, 61, 62, 148].

В 1980-90 годах были получены экспериментальные подтверждения присутствия в кровотоке здоровых лиц сотен разных по антигенной направленности естественных (физиологических) аутоантител (а-АТ): к гормонам, рецепторам, белкам цитоскелета, многим ферментам, ДНК, компонентам межклеточного матрикса, гистонам, маркерам главного комплекса гистосовместимости и другим эндогенным соединениям. Такие аутоантитела участвуют в клиренсе организма от продуктов естественного отмирания клеток в ходе апоптоза [19, 60, 61, 62, 65, 148, 151].

Апоптоз (от греческого apoptosis - опадание) - запрограммированная гибель клетки. Механизм программированной клеточной гибели направлен на удаление функционально или структурно неблагополучных клеток, что имеет важное биологическое значение, так как фрагментация ДНК в процессе апоптоза препятствует переносу генетического материала в другие клетки [54, 60, 61, 62, 65, 109, 110, 111, 132, 148, 151].

Апоптоз наблюдается в различных клеточных популяциях. В биологическом смысле апоптоз является механизмом гомеостатической регуляции и обеспечения правильной дифференцировки клеток. Под воздействием радиации происходит апоптоз в пролиферирующих клетках эпителия кишечника и в непролиферирующих клетках иммунной системы. На сегодняшний день известно, что при различных заболеваниях контроль клеточного состава также осуществляется путем апоптоза. Так, уменьшение концентрации соответствующего гормона приводит к апоптозу клеток в эндокринно - зависимых тканях (к примеру, апоптоз клеток коры надпочечников после подавления синтеза АКТГ глюкокортикоидами). Апоптотическая гибель клеток наблюдается и в тканях, подвергшихся ишемии [54, 60, 61, 62, 65, 109, 110, 111, 138, 145, 148, 151].

Все вышеперечисленное еще раз указывает на то, что апоптоз является широко распространенным общебиологическим механизмом поддержания постоянства численности и контроля функциональной полноценности клеток, обеспечивающим ликвидацию дефектных клеток [54, 60, 66, 110, 115, 132, 138, 145, 151].

В иммунной системе функция специфического распознавания «чужого» принадлежит лимфоцитам. После захвата антигенов фагоцитирующие клетки (моноциты, макрофаги и полиморфноядерные нейтрофилы) представляют их для распознавания Т-лимфоцитам. Этот процесс известен как презентация антигена. Распознав антиген, Т-лимфоциты путем выделения цитокинов активируют фагоциты и вызывают разрушение поглощенных ими чужеродных агентов. Другой тип взаимодействия предусматривает использование фагоцитами антител, образуемых В-лимфоцитами, для собственного, более эффективного распознавания возбудителей. Гуморальный иммунный ответ опосредован В-лимфоцитами. После распознания антигена В-лимфоциты начинают активно синтезировать антитела по принципу «один тип антигена - один тип антитела». Поскольку и на поверхности, и внутри одной чужеродной клетки находится большое различных антигенов, В-лимфоциты синтезируют множество антител, каждое из которых при этом направлено на определенный антиген [4, 60, 61, 62, 66, 148, 151].

Биологическая роль иммунной системы заключается в поддержании постоянства молекулярного состава организма и гомеостатической регуляции самых разных молекулярно-клеточных процессов [60, 61, 62, 132, 148, 151]. В этой связи особого внимания заслуживают естественные аутоантитела (а-АТ), которые, являясь стабильными молекулами, содержатся в крови в относительно высоких концентрациях. Важно, что сывороточное содержание а-АТ одной и той же антигенной специфичности оказывается примерно одинаковым у разных здоровых лиц, однако меняются при развитии множества серьезных болезней. При этом лабораторным свидетельством наличия патологии является как патологически высокий, так и низкий уровень а-АТ в сыворотке крови [60, 61, 148, 151].

Соответствующие тесты давно используются в эндокринологии в диагностике, в частности, заболеваний щитовидной железы и сахарного диабета типа 1 [41, 62, 63, 64, 83], а также для диагностики и прогноза соматических, преимущественно, аутоиммунных болезней [19, 40, 60, 61, 62, 65, 66, 67, 120]. Более 20 лет исследования сывороточного содержания многих а-АТ используется и в акушерстве для прогноза развития беременности [20, 30, 38, 60, 64, 87, 141, 152]. В последнее время появились работы, направленные на изучение изменений сывороточного содержания ауто-АТ при преэклампсии [20, 80, 119, 167, 168]. Рисунок 1.

Присоединение а-АТ (Agonistic Antibodies) к соответствующему рецептору на поверхности мембраны [119]

В 1984 г. в Базельском институте иммунологии была присуждена Нобелевская премия Нильс К. Жерне за обоснование представленной сетевой (идиотип- антиидиотипической) теории регуляции иммунитета. Основная суть данной теории в том, что иммунная система человека в норме продуцирует антитела (АТ1) как к антигенам экзогенного происхождения, так и к любым антигенам собственного организма, так называемые аутоантитела (а-АТ). При этом, являясь белковыми структурами и в свою очередь представляя собой антиген, АТ1 (именуемые идиотипами) индуцируют синтез антиидиотипических, вторичных антител (АТ2). Таким образом, антигенспецифичные АТ1 и их функциональные антиподы, соответствующие им АТ2, взаимодействуя между собой и с мембранными антигенными рецепторами многочисленных клонов иммунокомпетентных клеток, формируют идиотип-антиидиотипическую сеть.

Дальнейшие исследования подтверждают, что миллиарды клонов специализированных иммунокомпетентных клеток являются источником продукции 20-30 тыс. молекул а-АТ ежеминутно [63, 65, 148, 151]. На сегодняшний день установлено, что около половины а-АТ, циркулирующих в кровотоке, относится к классу IgG Продукция а-АТ осуществляется преимущественно С0⁵+-лимфоцитами, составляющими около 30% от общей B- клеточной популяции. При этом большинство естественных а-АТ

моноспецифичны по своей антигенной направленности.

Естественные а-АТ выполняют важные регуляторные функции. Одним из важнейших их свойств является способность а-АТ специфически

взаимодействовать с антигенами-мишенями, меняя их конформационные характеристики. Исследования последних лет указывают на возможность влияния а-АТ на пространственную структуру белков, контроля ферментативной активности за счет ингибирования или стимуляции определенных функциональных зон антигенов. Таким образом, обладая способностью контролировать, обратимо менять функциональную активность своих антигенов - мишеней, а-АТ оказываются важным звеном в регуляции гомеостаза [19, 52, 60, 65, 91, 92, 148, 151].

Известно, что естественные а-АТ ко многим биологически активным веществам, таким как инсулин, фактор роста нервов, вазоактивный интестинальный пептид, цитокины и др., обладают способностью специфически связывать и, за счет этого, предохранять эти не стабильные молекулы от преждевременного протеолиза. Гормонспецифические регуляторные а-АТ обеспечивают также транспорт молекул к соответствующим рецепторным участкам, где происходит диссоциация комплексов антиген-антитело и взаимодействие молекул гормона со специализированными рецепторами [52, 91, 92]. Это способствует значительному повышению биологической эффективности действия гормонов.

На сегодняшний день доказано, что представления о роли АТ исключительно как о методе защиты от инфекционных агентов являются не достоверными. Биологическое значение АТ, как и иммунной системы в целом, связано с поддержанием молекулярной аутентичности организма и гомеостатической регуляции различных молекулярно-клеточных процессов [19, 60, 61, 62, 132, 148, 151].

Сравнительно недавно начато изучение еще одного свойства аутоантител - их способности выступать в роли катализаторов различных биологических реакций. Первые антитела-абзимы были получены при иммунизации лабораторных животных стабильными аналогами антигенов с последующим выделением и отбором клонов В-лимфоцитов, способных продуцировать антитела с заданными каталитическими свойствами [52, 91, 92].

Сходство состояния иммунной системы при аутоиммунной патологии с состоянием иммунной системы женщины во время беременности определяет ряд общих параметров. Одним из них является увеличение в кровотоке уровня внеклеточной ДНК. Этот признак характерен практически для всех заболеваний аутоиммунного генеза, в то же время он выявлен во время беременности, в течение первого триместра у совершенно здоровых женщин. Кроме того, для аутоиммунных заболеваний характерна массовая гибель клеток путем апоптоза [19, 60, 61, 62, 132, 138, 145, 148]. В последнее время в литературе приводятся данные исследований, указывающие, что сходные процессы происходят у беременных в третьем триместре, непосредственно перед родами [20, 30, 38, 64, 66, 152].

В настоящее время истинные аутоиммунные процессы практически не поддаются коррекции и характеризуются длительным хроническим течением с периодами обострений и ремиссии. Однако, в период беременности и лактации специфическое состояние иммунитета является временным и обратимым.

Состояние физиологической нормы подразумевает поддержание определенной оптимальной концентрации любых регуляторных молекул, в том числе и естественных а-АТ. В случае, если содержание тех или иных а-АТ в сыворотке крови превышает, либо оказывается значительно ниже допустимых физиологических значений в течение длительного времени, в клетках соответствующих тканей и органов неизбежно развиваются патологические изменения. При избыточной продукции а-АТ эти изменения выявляются в виде функциональных или морфологически определяемых деструктивных аутоиммунных процессов, при недостатке синтеза и секреции определенных видов физиологических а-АТ - в виде существенно менее изученных нарушений общего гомеостаза. В силу чрезвычайно высокой специфичности АТ, нарушения в продукции каких - либо видов а-АТ определяют характерные особенности клинической симптоматики имеющегося заболевания [52, 60, 61, 62, 132, 148, 151].

У всех здоровых лиц на протяжении всей жизни продуцируется огромное число естественных аутоантител и аутореактивных лимфоцитов, распознающих собственные антигены. Крайне важно, что сывороточное содержание а-АТ одной и той же конкретной антигенной специфичности оказывается примерно одинаковым у разных здоровых лиц. Иммунная система осуществляет постоянный скрининг антигенного состава тела, его сличение с исходным образом - матрицей и, при выявлении каких - либо расхождений с «идеальным» образом - моделью, запускает работу механизмов коррекции и\или репарации, призванных восстановить исходный образ. В отличие от состояния нормы, сывороточные концентрации многих а-АТ в значительной степени меняются при развитии множества серьезных болезней, что можно использовать в диагностических и прогностических целях.

Еще задолго до клинической манифестации патологического процесса в определенных группах клеток начинаются долгосрочные патохимические изменения, неизбежно сопровождающиеся изменениями со стороны синтеза АГ в специализированных клетках органа. Эти изменения оказываются специфичными для каждой патологии. В ответ на формирующееся неблагополучие иммунная система запускает синтез высокоспецифичных регуляторных аутоантител. Отмеченные закономерности создают реальные шансы на создание методов максимально - раннего выявления формирующейся патологии.

На сегодняшний день существует ряд исследований [19, 27, 40, 41, 60, 63, 64, 67, 83, 120, 148, 151, 152], доказывающих диагностическую и прогностическую достоверность определения уровня аутоантител в сыворотке крови при различных патологических состояниях. Так, по содержанию нейротропных аутоантител у больных ишемическим инсультом можно судить о степени выраженности неврологических нарушений и дальнейшем течении заболевания. Особенности продукции сывороточных АТ к различным амилоидным структурам A-пептида и лизоцима человека, а также белку S100b позволяют предположить возможное их прогностическое значение при прогрессивном развитии болезни Альцгеймера и нарушениях когнитивных функций [67, 152].

Доказано влияние аутоантител на формирование патологии щитовидной железы. У пациентов с болезнью Грейвса (диффузный токсический зоб) аутоантитела к антитиреотропину активируют рецепторы тиреотропина, увеличивая продукцию тироксина [19, 61, 65]. У больных СД 1 типа

определяется аномально повышенное содержание антиинсулиновых а-АТ в сыворотке крови. Уровни патологической продукции а-АТ, вероятно, зависимы от степени компенсации данного заболевания и дозы экзогенно вводимого инсулина, а также длительности инсулинотерапии, форм и степени очистки гормонального препарата и других условий [41, 61, 63, 83].

Данные, полученные при проведении экспериментов на лабораторных животных, а также клинические наблюдения за новорожденными, матери которых имели повышенные уровни а-АТ к инсулину, свидетельствуют, что связывание инсулина избытком антител может сопровождаться развитием умеренно выраженного гипогликемического состояния. По данным литературы, вероятно, развитие гипогликемии связано со снижением протеолитической деградации гормона и, соответственно, пролонгировании его биологического действия [41, 60, 63, 83].

Известно, что повышение титров АТ ко многим антигенам поджелудочной железы может быть выявлено за несколько лет до клинической манифестации болезни. При этом динамика нарастания уровней антиинсулиновых антител в стадии "предиабета" прямо пропорциональна времени клинической манифестации заболевания. Это позволило использовать подобные тесты для выявления лиц группы повышенного риска развития заболевания и прогноза развития сахарного диабета. Имеющиеся литературные данные указывают на возможное участие АТ к антигенам Р-клеток в их деструкции, которое может реализовываться посредством антителозависимых цитотоксических механизмов. При этом снижение содержания антител к инсулиновым рецепторам у больных сахарным диабетом 2 типа типа в проведенных исследованиях сопровождалось клинически выраженной ремиссией [41, 83].

В мировой литературе есть указания на наличие специфических рецепторов а- АТ к ангиотензину в ткани почечных аллотрансплантантов [119, 120, 167]. Известно, что отторжение аллотрансплантата остается главной проблемой в пересадке почки. Процесс отторжения аллотрансплантата, предположительно, регулируется Т-лимфоцитами, риск увеличивается при выявлении в сыворотке крови пациента высоких титров анти-HLA антител до пересадки почки. Анти- HLA антитела могут активировать каскад событий, которые приводят к апоптозу эндотелиальных клеток и повреждению ткани сосудов, что дает основания предполагать, что патогенетической будет терапия, направленная непосредственно на снижение уровня этих антител или на их дезактивацию. В литературе приводятся результаты исследования сывороточного содержания аутоантител к ангиотензину, уровень которых был в значительной степени повышен у пациентов с признаками тяжелого сосудистого отторжения и наличием злокачественной артериальной гипертензии, при этом анти-HLA антитела в сыворотке крови отсутствовали [120]. Подобным образом, ряд исследователей отмечает взаимосвязь избыточной продукции антител ангиотензин₁-рецептора с развитием у пациентов тяжелой артериальной гипертензии как вне, так и во время беременности [119]. Известно, что плацента не является препятствием для поступления материнских АТ к плоду. Трансплацентарный перенос материнских АТ, идущий за счет активных энергозависимых механизмов, обеспечивает избыточное накопление материнских АТ в организме плода.

Для выявления специфических иммунных изменений, а именно а-АТ, уже более 10 лет используют методы группы ЭЛИ - Тест. В основе этих методов лежит твердофазный иммуноферментный анализ, позволяющий выявлять аномалии в сывороточном содержании а-АТ класса IgG определенной антигенной специфичности. При выявлении стойких аномалий в сывороточном содержании а-АТ можно проанализировать характер и степень выраженности патологических изменений, а также оценить адекватность лечения, оптимизировать тактику ведения пациента, в том числе и на доклиническом этапе [27, 60, 66, 151].

В ряде экспериментальных работ [19, 20, 41, 62, 64, 148, 151] было убедительно продемонстрировано, что патологическая гиперпродукция, а также аномально низкий уровень некоторых материнских а-АТ может являться причиной остановок или нарушений эмбрионального развития. В настоящее время удалось идентифицировать ряд естественных регуляторных а-АТ класса IgG, синтезируемых в материнском организме, определенный уровень которых обеспечивает нормальное развитие плода. К подобным, так называемым, «эмбриотропным» аутоантителам относятся а-АТ к основному белку миелина, белкам S100, АСВР14/18 и МР-65. В проведенных исследованиях было установлено, что концентрация этих АТ у здоровых женщин репродуктивного возраста поддерживается в пределах границ узкого физиологического интервала (150-250 нг/мл в сыворотке крови). В то же время у пациенток, имевших какие - либо неблагоприятные исходы беременности, содержание эмбриотропных АТ в сыворотке крови выходит за установленные границы физиологической нормы [20, 30, 38, 41, 64, 87, 152].

Установлено, что стойкие изменения уровней продукции АТ могут вызываться множеством независимых или сочетанных причин. Иммунная система организма молниеносно реагирует на самые разнообразные неблагоприятные экзогенные воздействия, активируя при этом множества клонов иммунокомпетентных клеток, в том числе и те, которые отвечают за продукцию эмбриотропных АТ.

Поэтому любые потенциально тератогенные факторы (бактериальные и вирусные инфекции, химические поллютанты, радиоактивные загрязнения, сильные и продолжительные стрессорные воздействия и т.п.) могут влиять на развитие эмбриона и плода за счет накопления в материнском организме и индукции в нем определенных молекулярных изменений, отражающихся затем в нарушении эмбрио/фетогенеза.

Анализ взаимосвязи патологических уровней исследуемых а-АТ и нарушениями системы гемостаза показал, что имеется прямая корреляционная зависимость между уровнем а-АТ к коллагену базальных мембран и тромбиновым временем, а также уровнем ауто-АТ к ANCA и уровнем фибриногена и АЧТВ, коалиновым временем в крови. Полученные данные свидетельствуют о наличии аутоиммунных механизмов нарушения маточноплацентарного кровотока у беременных с возможной их реализацией через воздействие на состояние системы гемостаза. Кроме того, была выявлена взаимосвязь развития патологии плаценты и исхода родов с наличием повышенного уровня некоторых а-АТ. Так, повышенные уровни а-АТ к двуспиральной ДНК или к ХГЧ вызывали увеличение риска развития отёка пуповины, амниона, гиперемии межворсинчатого пространства (признаки воспалительной реакции). Повышение а-АТ к Fc фрагментам IgG, ANCA и р-2 гликопротеину инициировали легкую форму базальной лейкоцитарной дегенерации [20, 41].

В соответствии с полученными результатами некоторых исследований, отмечено аномальное снижение лабораторных показателей содержания аутоантител к NO-синтетазе, двуспиральной ДНК, аутоантител к МР-65, NF-200, АNCA в группе беременных, имевших преэклампсию в 3 триместре беременности. При этом исследование сывороточного содержания аутоантител у пациенток из данной группы проводилось за 4 и более недель до клинической манифестации заболевания [20, 64, 65, 152].

Перспективным достоверным методом ранней доклинической диагностики представляется группа методов ЭЛИ - Тест, в частности Эли- нефро- Тест, Эли - тромбо - Тест, выявление АТ к ДНК, АТ к коллагену, АТ к р2 - гликопротеину. АТ к ДНК, АТ к коллагену, АТ к р2 -гликопротеину - являются естественными АТ, изменения которых является универсальным признаком изменений активности иммунной системы. Такие АТ участвуют в клиренсе организма от продуктов естественного отмирания клеток в ходе апоптоза, нормальные уровни их сывороточного содержания поддерживаются в узких диапазонах, а их продукция значительно повышается при активации процессов апоптоза, при любых инфекционно - воспалительных процессах и существенно снижается при поликлональной иммуносупрессии [19, 60, 61, 62, 117, 148, 151].

Двуспиральная ДНК является компонентом ядерных клеток; увеличение концентрации свободной и фрагментированной ДНК в циркуляции указывает на активацию процессов апоптоза. Помимо ДНК, одними из основных продуктов распада клеток, отмирающих путем программированной клеточной гибели, являются фосфолипиды клеточных мембран. Как следствие, имунная система получает стимул к избыточному образованию анти-ДНК антител. Об активации процессов апоптоза также свидетельствует повышенный уровень а-АТ к р2- гликопротеину - белку, образующему комплексы с фосфолипидами сыворотки крови. Активация апоптоза наблюдается, например, при различных инфекционно - воспалительных процессах или при системных аутоиммунных процессах. При этом повышается выброс ДНК и мембранных фосфолипидов, что в свою очередь индуцирует компенсаторное повышение синтеза а-АТ к ДНК и р2-гликопротеину.

Основным белком соединительной ткани является коллаген. Избыток а-АТ к нему в сыворотке крови является отражением врожденных или приобретенных нарушений в структуре и функции соединительнотканного матрикса [19, 27, 60, 61, 62, 148, 151].

Однако, отдельно взятые уровни аутоантител к ДНК, р2-гликопротеину, коллагену не отражают характер патологического процесса. Вот почему поиск методов ранней диагностики такого осложнения беременности, как преэклампсия, должен включать в себя изучение специфических показателей почечных, печеночных и сосудистых нарушений.

Метод Эли-тромбо-Тест позволяет выявить изменения сывороточного содержания АТ к антигенам мембран тромбоцитов (TrM-001-15; TrM-008-10; TrM-015-12). Предназначается для выявления аутоиммунных тромбоцитопатий, а также для выявления имеющихся или начинающихся васкулитов и мониторинга за их динамикой. Изменение уровня а-АТ к тромбоцитам может сопровождаться как повышенной агрегацией тромбоцитов, активацией тромбообразования так и повышенным лизисом тромбоцитов, тромбоцитопенией и повышенной кровоточивостью.

Метод ЭЛИ-Нефро-Тест позволяет оценить сывороточное содержание а-АТ, направленных к ряду растворимых и мембранных антигенов почек (KiM-05-300, KiM-05-40, KiS-07-120), экспрессируемых в повышенных количествах при патологических процессах, затрагивающих паренхиму почек. Предназначается для выявления имеющихся или начинающихся почечных заболеваний и мониторинга за их динамикой. Стойкое повышение АТ, тропных к антигенам почечной ткани, может указывать на развитие воспалительных и дистрофических изменений в почках инфекционного, токсического или аутоиммунного генеза [19, 27, 40, 60, 148, 151]. Изменения в АТ к цитоплазматическому антигену KiS-07- 120 свидетельствует о функциональных изменениях в ткани почек, не сопровождающихся деструктивными процессами. Напротив, стойкие изменения в содержании АТ к мембранным белкам KiM-05-300 и KiM-05-40 могут являться индикатором деструктивных процессов в почках [19, 27, 40, 60, 148, 151].

Метод ЭЛИ-Гепато-Тест позволяет выявить изменения в продукции сывороточном содержании гепатотропных АТ. Стойкое повышение АТ, тропных к антигенам печеночной ткани, указывает на развитие дистрофических и воспалительных изменений в ткани печени инфекционного, токсического или аутоиммунного генеза. Изменения в АТ к цитоплазматическим антигенам HeS- 08-300 и HeS-08-40 обычно свидетельствует о функциональных изменениях в ткани печени, не сопровождающихся активной деструкцией гепатоцитов. Напротив, стойкие изменения в содержании АТ к мембранным белкам митохондрий (HMMP) являются индикатором деструктивных процессов в печени [19, 27, 40, 60, 148, 151].

При изучении литературы, касающейся некоторых показателей состояния аутоиммунитета во время беременности, осложненной развитием преэклампсии, мы обнаружили единичные исследования, и те довольно разноречивы [20, 30, 64, 80, 99, 167, 168].

В частности, уровни естественных аутоантител при преэклампсии в литературе исследовали Замалеева РС. и соавторы (2008), которые пришли к выводу, что при беременности, отягощенной преэклампсией, уровень аутоантител снижается обратно пропорционально степени тяжести преэклампсии. В то же время при некоторых формах преэклампсии, как отмечали авторы, наблюдается дисбаланс отдельных групп исследуемых а -АТ [20].

Однако ни одно из существующих в настоящий момент исследований не дает убедительного ответа в вопросах дифференциальной диагностики преэклампсии и хронических гипертензивных состояний. Исследование маркеров имеющихся нарушений и их дальнейшая трактовка находятся в процессе дополнительного изучения.

Исходя из понимания важной биологической роли а-АТ в патофизиологии различных заболеваний и процессов, а также учитывая актуальность проблемы развития преэклампсии во время беременности, представляет интерес поиск оптимальных критериев для диагностики и дифференциальной диагностики преэклампсии, в том числе на доклиническом этапе.