Использование новейших технологий в поиске биомаркеров, ассоциированных с опухолями яичников

Основными характеристиками биомаркеров являются:

чувствительность, специфичность и положительная оценка предсказания (positive predictive value, PPV). Чувствительность - это процент пациентов, классифицированных с использованием данного маркера как «больные раком», от общего числа действительно больных пациентов.

Для того чтобы маркер можно было использовать в практике, должны быть достаточно велики показатели его чувствительности и специфичности. Удобно использовать для характеристики биомаркеров понятие точности диагностики, под которой подразумевается процент правильных диагнозов [Jacobs et al, 2004].

Распространенным подходом к увеличению чувствительности и специфичности метода диагностики является совместное использование нескольких маркеров. Для создания системы диагностики на основе набора биомаркеров необходимо использовать методы многомерной статистики и вырабатывать более сложный алгоритм классификации [Skates et al, 2004].

Из методов биоинформатики чаще всего применяют методы логистической регрессии, построения классификационного древа и дискриминантный анализ. Метод логистической регрессии позволяет на основе экспериментальных данных вывести формулу, включающую в качестве переменных концентрации биомаркеров. Метод дискриминантного анализа позволяет аппроксимировать на основе экспериментальных данных многомерную плотность вероятности для распределения здоровых и больных. Модель, построенная с помощью дискриминантного анализа, возвращает вероятность признака «рак» на основе отношения плотностей вероятности для признаков «рак» и «отсутствие рака».

Предпринимались многочисленные попытки использовать в комбинации с СА125 для диагностики рака яичника белки, известные как биомаркеры различных видов рака: СА15-3 (маркер рака молочной железы) [Jacobs et al, 1993; Woolas et al, 1995; Zhang et al, 1999; Li et al, 2002; Skates et al, 2004], СА72-4 (маркер рака поджелудочной железы) и M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor - макрофагальный колонии-стимулирующий фактор) - цитокин, стимулирующий пролиферацию лимфоцитов, липид-

ассоциированную сиаловую кислоту (LASA), известную как маркер рака мозга [Katopodis et al, 2001] и рака молочной железы [Brower et al,1995] и некоторых других видов рака, OVX1 - маркер рака эндометрия [Xu et al, 1994], CA9 - маркер рака почек, а также CA54/61, являющийся маркером рака яичника [Nozawa et al,1992]. Однако все упомянутые маркеры обладают низкой специфичностью для конкретного вида рака, и их концентрация во многих случаях изменяется по сравнению с нормой и при раке яичника.

Использование панелей из 4-5 указанных белков позволило улучшить специфичность и чувствительность метода, по сравнению с одним СА125: для ранней стадии рака яичников удалось повысить чувствительность от 45% до 70% при неизменной специфичности [Skates et al, 2004], для отличия доброкачественных и злокачественных опухолей яичников - с 78,1% и 76,8% соответственно, до 90,6% и 93,2%, соответственно [Woolas et al, 1995]. Таким образом, было четко показано, использование не одного, а набора биомаркеров является перспективным подходом к диагностике.

Поиск панелей биомаркеров, а также комбинирование биомаркеров, обнаруженных разными методами, является основной идеологией большинства современных исследований в области разработки биохимических диагностических методов.

Однако использование транскриптомного профилирования для разработки новых диагностических методов достаточно ограничено, так как путь от выявления отличий на уровне транскриптома до выявления биомаркера, доступного для измерения малоинвазивными методами, достаточно сложен. Примером успешного обнаружения биомаркера путем транскриптомного профилирования является работа Le Page с соавторами.

Обнаружив повышение экспрессии генов IL-18 и FGF-2 в тканях рака яичника, авторы измерили методом иммуноферментного анализа концентрацию соответствующих белков и обнаружили достоверное повышение их уровня, как в ткани яичника, так и в крови [Le Page et al, 2006].

С развитием протеомных технологий открылись совершенно новые перспективы по выявлению белковых маркеров рака. Протеомные технологии позволяют получать информацию сразу о больших совокупностях белков и сравнивать наборы белков у больных и здоровых людей, что дает возможность выявлять не один, а сразу несколько маркеров.

Среди протеомных методов, используемых для непосредственного обнаружения и идентификации биомаркеров, существенную роль играет двумерный электрофорез с последующей масс-спектрометрической

идентификацией белков. Метод двумерного электрофореза позволяет осуществлять разделение белков в одном направлении путем

изоэлектрофокусирования, а в другом направлении - по массе [Говорун В.М., Арчаков А.И., 2002].

В качестве материала для двумерного электрофореза часто используют не кровь, а непосредственно опухолевые и нормальные ткани исследуемого органа. Однако как здоровые, так и опухолевые ткани представлены различными типами клеток, что усложняет воспроизводимость и интерпретацию результатов. Решить эту проблему в значительной степени позволило изобретение метода лазерной микродиссекции, с помощью которого можно отделить интересующую клеточную популяцию от окружающих тканей [Craven et al, 2002; Wulfkuhle et al, 2003].

Помимо классического двумерного электрофореза для обнаружения маркеров заболеваний используют также его усовершенствованные варианты, например, дифференциальный электрофорез в геле (DIGE). Белковые экстракты из больной и здоровой тканей метят двумя различными флуоресцентными зондами и смешивают. Затем проводят двумерный электрофорез, после чего для каждого пятна измеряют интенсивность флуоресценции и определяют различие в интенсивности между двумя флуоресцентными метками. Такой подход позволяет достичь полной идентичности условий проведения электрофореза и за счет этого повысить воспроизводимость результатов [Unlu, Morgan & Minden, 1997; Zhou et al,

2002] .

Большие перспективы имеет технология микрочипов на основе антител, которая представляет собой одновременный анализ сотен белков в пробе на микрочипах с иммобилизованными антителами. Примером успешного поиска биомаркеров рака яичника с использованием микрочипов на основе антител представляет собой работа Mor с соавторами. С их помощью были проанализированы уровни 169 белков у 28 здоровых женщин, 18 женщин с впервые диагностированным раком яичника и 40 женщин с рецидивом рака яичника. Были обнаружены достоверные отличия между сыворотками больных раком и сыворотками здоровых женщин в концентрациях 35 из 169 исследованных белков. Затем концентрации белков с наиболее выраженными различиями между раком и нормой, а также с достаточно ясной потенциальной ролью в процессе злокачественного перерождения были определены с помощью иммуноферментного анализа. В результате в качестве биомаркеров были отобраны лептин, пролактин, остеопонтин (OPN) и инсулиноподобный фактор роста II (IGF-II). Уровень пролактина и OPN существенно повышен у больных раком яичника, в то время как уровень лептина и IGF-II понижен. Совместное использование четырех перечисленных биомаркеров позволило достичь чувствительности и специфичности диагностики 95%. Недостатком использования микрочипов на основе антител относится высокая стоимость расходных материалов и необходимость иметь антитела ко всем анализируемым белкам. Кроме того, использование антител в большинстве случаев не позволяет различить между собой различные посттрансляционные модификации белков, а также фрагменты белков [Mor et al, 2005].

Этими недостатками не обладают масс-спектрометрические методы, которые очень активно развиваются и с успехом применяются для поиска биомаркеров злокачественных опухолей, в том числе, рака яичника. Масс- спектрометрические методы позволяют получать спектры распределения белков в смеси по массе.

Методы масс-спектрометрии позволяют очень быстро анализировать большое количество образцов, требуют сравнительно небольшого количества биологического материала, обладают высокой чувствительностью и хорошим разрешением для низкомолекулярных белков и пептидов, что делает особенно перспективным их использование для поиска биомаркеров [Petricoin & Liotta,

2003] .

Из прямых масс-спектрометрических методов для обнаружения биомаркеров заболеваний лучше всего приспособлена технология SELDI-TOF, совмещающая в себе масс-спектрометрическую детекцию белков с использованием белковых чипов. Белковый чип представляет собой пластинку с 8-ю пятнами хроматографической поверхности, на которую наносят образцы исследуемой жидкости перед анализом. Используются чипы с различной хроматографической поверхностью: гидрофильной (нормально-фазовые), гидрофобной (обращенно-фазовые), анионообменные, катионообменные или металлоаффинные. Кроме того, существуют чипы с активированной поверхностью для связывания любого аффинного сорбента. В зависимости от типа чипа и используемого буфера с активной поверхностью связывается разный набор белков, а не связавшиеся белки отмываются. После отмывки чип со связавшимися белками высушивают и наносят на матрицу, помещают в вакуумную камеру, а пятна облучают лазером. Ионизованные за счет энергии лазера белки отрываются от поверхности чипа, по вакуумной трубке летят к противоположно заряженному электроду и там детектируются [Говорун В.М.

и Арчаков А.Н., 2002].

Использование чипов позволяет проводить упрощенное хроматографическое фракционирование биологической жидкости перед масс- спектрометрическим анализом. В результате полученные спектры содержат более или менее хорошо разрешенные пики. Применение масс-спекрометрии SELDI-TOF началось с разработки компьютерных методов классификации спектров, рассматриваемых как «черные ящики», то есть без идентификации биомаркеров, и в первых же работах были достигнуты высокие значения чувствительности и специфичности диагностики [Petricoin et al, 2002; Kozak et al, 2003]. В других работах некоторые дискриминаторные пики были идентифицированы [Rai et al, 2002; Zhang et al, 2004; Moshkovskii et al, 2005; Kozak et al, 2005].

Метод SELDI-TOF имеет очень высокую производительность. В течение дня могут быть проанализированы десятки образцов. Кроме того, процедура может быть автоматизирована, и тогда производительность повышается еще во много раз. В качестве биологического материала для исследования с помощью SELDI-TOF могут быть использованы, как биологические жидкости (плазма крови, моча), так и белковые экстракты из тканей. Технологию SELDI-TOF можно использовать как альтернативу двумерному электрофорезу для поиска биомаркеров и их дальнейшей идентификации [Petricoin & Liotta,

2004] .

Возможен также другой подход. Так как процедура получения спектров достаточно проста, при использовании плазмы или сыворотки крови спектры можно применять не только в качестве объекта исследования, но и как диагностический признак [Rodland, 2004].

Несмотря на множество преимуществ технологии SELDI-TOF, реальные ее возможности являются предметом ожесточенных дискуссий в научном сообществе. Одной из основных проблем является присутствие в сыворотке больших концентраций мажорных белков (например, альбумина). По сравнению с ними концентрации большинства кандидатных маркеров, вероятнее всего, ничтожны. К сожалению, реальные пределы чувствительности метода при работе не с изолированными белками, а со сложной смесью, такой как сыворотка, еще не определены. На данном этапе технология SELDI-TOF широко применяется для разработки диагностики различных видов рака, оставаясь при этом в значительной степени эмпирическим методом [Diamandis, 2003; Diamandis, 2004].

Для разработки адекватного диагностического метода большое значение имеет правильный подбор выборок. Достоверность и универсальность результатов во многом определяется именно этим. Прежде всего, не должно быть статистически значимых отличий между сравниваемыми выборками по другим признакам, кроме наличия или отсутствия болезни [White et al, 2005]. Для этого во всех исследованиях используют сыворотки крови пациентов с впервые диагностированным раком, еще не проходивших никаких курсов лечения, так как результаты лечения сами по себе могут существенно отразиться на структуре белка. Исследуемые группы не должны заметно различаться по среднему возрасту, иначе найденные отличия могут быть следствием не болезни, а возрастных изменений. Другим источником систематических отличий могут быть различия в методиках получения или хранении образцов сыворотки вследствие того, что контрольные сыворотки получены из другого источника, чем сыворотки больных раком [White et al,

2005] .

1.5.