Методы лабораторной диагностики заболеваний, ассоциированных с микоплазменной инфекцией

Длительное бессимптомное течение воспалительного процесса при МИ, отсутствие специфических симптомов, полиморфизм клинических проявлений существенно затрудняют диагностику МИ. Решающее значение в выявлении МИ получили методы лабораторной диагностики, основной целью которой является подтверждение присутствия возбудителя, его антигенов, специфических фрагментов ДНК.

Для диагностики МИ используют молекулярно-биологические методы, к которым относятся ПЦР и ПЦР в режиме реального времени; микробиологический и иммунологические методы, представленные иммуноферментным анализом, реакцией непрямой иммунофлуоресценции, реакцией пассивной гемагглютинации. [12,19,20]. Наиболее часто для точной постановки диагноза необходимо сочетание разных диагностических методов. Проблемы выявления возбудителя МИ связаны с несколькими причинами: отсутствием случаев обнаружения их как моноинфекции; возможностью длительного латентного существования, наиболее частое выявление их с другими видами возбудителей - хламидийно- трихомонадные, хламидийно-гонококковые и др. Выявление персистирующих форм МИ является диагностически сложной задачей, требующей комплексного подхода к лабораторному обследованию пациентов.

Среди методов лабораторной диагностики наиболее часто применяется скрининг с использованием ПЦР и реакции иммунофлюоресценции (РИФ). Выбирая тот или иной метод диагностики мы руководствуемся критериями чувствительности и специфичности теста. Чувствительность определяется как доля лиц с положительным результатом, полученным при использовании данного метода в популяции с изучаемым заболеванием. Специфичность - доля лиц с отрицательным результатом, полученным при использовании данного метода в популяции, где изучаемое заболевание отсутствует.

Серологические методы. Суть иммуноферментного анализа состоит в визуализации реакции антиген-антитело люминесцентными маркерами. Различают МФА прямой, при прямом методе на препарат с антигеном наносят известную, предположительно соответствующую ему, люминесцирующую сыворотку. В случае образования комплекса, он обнаруживается, люминесцентной микроскопией в виде зеленоватого свечения разной степени интенсивности и четкости. При непрямом методе на мазок из наслоения антигена и немеченой сыворотки наносят антиглобулиновую (видовую по отношению к диагностической сыворотке) люминесцирующую сыворотку. В случае образования комплекса антигенантитело, последний компонент реагирует с видовой антиглобулиновой люминесцирующей сывороткой. При непрямом МФА с комплементом, его добавляют к комплексу антиген-антитело и идентифицируют образование тройного комплекса по люминесцирующей антикомплементарной сыворотке.

Результаты описываются в так называемых «крестах» (от одного + до четырех ++++) - субъективная градация исследователем степени

выраженности реакции. Непрямые методы требуют наличия только антиглобулиновых видовых сывороток с флюорохромами, но при этом необходимо большое количество тестовых контролей. При постановке прямым методом делается только один контроль, но требуется множество моноспецифических сывороток. Недостатками всех видов МФА является ограниченная чувствительность из-за наличия возможных перекрестных реакций между близкими по антигенному составу объектами и неспецифическая флуоресценция вследствие адсорбции флуоресцирующих глобулинов на различных элементах препарата.

В настоящее время используются коммерческие стандартные тестсистемы, содержащие глобулины к исследуемым антигенам. Данные ИФА показывают состояние иммунитета к определенному инфекционному агенту. По показанию данного метода диагностики можно определить наличие контакта с определенным видом возбудителя и активность процесса в организме. Учитывая факт, что микоплазменная инфекция обладает слабой иммуногенностью, этот метод не находит широкого применения в акушерстве и гинекологии.

Специфичность данного метода ограничивается лишь тем, что ряд бактерий имеют в своем составе общие с микоплазмами поверхностные антигены, за счет которого возможны ложноположительные реакции. Чувствительность при использовании моноклональных антител составляет около 80%, следует обратить внимание на качественную оценку результатов, полученных при использовании этого метода. Она зависит от качества используемых моноклональных антител, которые могут отличаться друг от друга по вызываемой яркости свечения и степени специфичности. Этим методом можно выявить микоплазмы в мазке из влагалища, уретры или шейки матки, а также в секрете предстательной железы.

ПЦР - диагностика. Метод ПЦР направлен на определение антигенов возбудителя непосредственно в клиническом материале. Специфичность ПЦР близка к 100%. Помимо преимуществ, таких как относительная дешевизна, отсутствие специальных условий хранения материала и высокая, контролируемая специфичность и чувствительность, благодаря чему возможно выявление не только остро протекающего инфекционного процесса, но и процесса с латентным течением, имеются и недостатки. Они связаны с временем проведения анализа, чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью, достоверностью, соотношением «цена-качество». Вместе с тем, только комплексное использование различных методов обследования позволяет получить данные о наличии или отсутствии МИ и характере течения процесса [8, 19].

ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью. В настоящее время проводят ее в автоматическом режиме с использованием лабораторных роботов. Перечисленные преимущества метода ПЦР привели к ее быстрому внедрению в повседневную диагностику многих заболеваний урогенитального тракта. При диагностике заболеваний, вызываемых микоплазмами, ПЦР принадлежит основополагающая роль.

К биологической особенности микоплазм относится исключительно малый размер их генома. У микоплазм и уреаплазм он составляет всего 450-550 МД. Другой мишенью, часто используемой при выявлении в пробе U.Urealyticum является ген уреазы, а для Mycoplasma Hominis - ген аргининдезаминазы [20]. К особенностям микоплазм относится выраженная гетерогенность и изменчивость антигенной структуры. Виды U. Parvum и U.Urealyticum отличаются по вирулентности и строению гена основного фермента - уреазы. Вид U. Parvum как правило сопровождает хроническое течение воспалительного процесса в урогенитальном тракте, а вид Ureaplasma urealyticum выявляется при бактериальном вагинозе. [44,46].

При применении ПЦР следует учитывать, что помимо обычных для микробиологических лабораторий предосторожностей, следует принимать меры для предотвращения присутствия даже следов ДНК патогенов, кроме того на результат влияют правильность проведения забора материала, соблюдение правил его хранения и транспортировки в лабораторию. Если рассматривать ПЦР исходя из диагностической значимости данного метода, то его применение позволяет лишь установить присутствие возбудителя. Еще одним существенным недостатком ПЦР, является возможность наличия в клиническом материале различных ингибиторов полимеразы.

Микоплазмы, обнаруживаемые в урогенитальном тракте, относятся к условно-патогенным микроорганизмам, поэтому установить этиологическую значимость выявленного возбудителя только лишь проведя ПЦР-диагностику не возможно. Компанией «ДНК - Технология», Россия, разработан детектирующий амплификатор ДТ-96, позволяющий проводить количественную оценку широкого спектра условно-патогенных микроорганизмов, в том числе трудно- и некультивируемых, это современные ПЦР-системы реального времени (Realtime PCR), основанные на использовании люминесцентных зондов, позволяют проводить количественные исследования [51,63,64].

Культуральные методы. Исходя из особенностей микоплазм, их минимальные размеры, сопровождаемые множественными дефектами в ферментной системе, они прихотливы к условиям культивирования, что осложняет их культивирование. В течение длительного времени считалось, что ряд видов, например, Mycoplasma genitalium, способны к размножению только в культуре клеток.

Все известные виды микоплазм можно культивировать на искусственных питательных средах. Большинство видов микоплазм растут медленно. Рост происходит на средах с добавлением сывороток (нуждаются в холестероле), рост происходит при температуре 35-37⁰С аэробно или анаэробно. Ключевым признаком для идентификации уреаплазм является образование аммиака из мочевины, при этом меняется рН среды в щелочную сторону. Для микоплазменной инфекции характерны микроколонии с более плотным центром, похожие на "яичницу-глазунью".

В настоящее время широко используют автоматические и полуавтоматические анализаторы, с помощью которых идентифицируют бактерии и определяют минимальную ингибирующую концентрацию антимикробных препаратов для конкретного возбудителя. Одним из последних достижений науки является внедрение в медицинскую лабораторную практику метода масс-спектрометрии. Данный метод обеспечивает высокую производительность и практически 100% специфичность и чувствительность, непревзойденную скорость анализа. Компания Biomerieux, Франция представляет новую систему идентификации микроорганизмов на платформе MALDI TOF MS, прибор получил название VITEK MS. Для идентификации бактерий определяется спектр белков напрямую из бактериальной клетки без

предварительной длительной пробоподготовки.

сертифицированных методов анализа. Структурированная таким образом база данных позволяет быстро и точно идентифицировать микробиологические штаммы. На идентификацию одного микроорганизма требуется меньше 2-х минут времени. Таким образом, главными преимуществами метода являются: достоверный результат за две минуты, высокая воспроизводимость анализа, значительная экономия средств, замена стандартных биохимических методов.

Факторы внешней среды оказывают на микоплазмы прямое воздействие. Транспортировка материала в лабораторию должна осуществляться в максимально кроткие сроки. Обычно доставку проб осуществляют в жидкой транспортной питательной среде без добавления источника стеролов. Далее в зависимости от схемы исследования делают высев на плотную или жидкую среду из транспортного бульона или его разведений. При этом сроки транспортировки могут составлять 4-5 ч при комнатной температуре и увеличиваться до 2 суток при условии хранения пробы при 4°С [78].

Забор мазков осуществляется до назначения антибиотикотерапии. Применяют стандартную микробиологическую методику,

предотвращающую контаминацию другими микроорганизмами. Перед взятием материала из влагалища предварительно удаляют излишек слизи с экзоцервикса. Для взятия экзоцервикального образца используют цитощетку, тампон или стерильный зонд. У беременных женщин материал берут с экзоцервикса.

Мазок из уретры берут после удаления слизи с отверстия мочеиспускательного канала путем соскоба ложечкой Фолькмана, спустя три часа после последнего мочеиспускания. Для посева можно использовать первую порцию мочи: исследуется центрифугированный осадок после разбавления его в небольшом количестве (0,1 мл) стерильного физраствора.

Микоплазмы являются факультативными анаэробами. Данные микроорганизмы лучше растут в анаэробных или микроаэрофильных условиях. Период инкубации посевов при заболеваниях, вызываемых микоплазмами, может достигать 6 дней. Он во многом зависит от состава и типа используемой среды, а также вида выделяемых микоплазм. При росте микоплазм на питательных средах происходит помутнение. Это связано с тем, что даже в самых благоприятных условиях концентрация микроорганизмов не превышает 10¹⁰ в 1 мл. Интенсивное помутнение свидетельствует о размножении контаминантов. Использование ингибиторов роста сопутствующей флоры (антибиотики, такие как, нистатин и ампициллин) позволяет выращивать практически чистые культуры микоплазм, даже в жидких средах. Проблема, связанная с антибиотикорезистентностью флоры актуальна в настоящее время особенно, зачастую материал для исследования содержит культуры микроорганизмов-контаминантов уже обладающих устойчивостью к достаточно часто применяемым антибиотикам [20,68,78].

Количественную оценку концентрации (>10⁴) М. hominis и U. urealyticum осуществляют путем раститровки биологического материала. Количественная оценка позволяет косвенно судить о степени выраженности воспалительного процесса, давности процесса, но, по мнению многих авторов, эти показатели не всегда коррелируют. По данным многих авторов уреаплазмы в высоких титрах у женщин обнаруживаются чаще, чем у мужчин [99].

1.10.