Микробиологическое исследование влагалищной флоры, цервикального канала и полости матки

С целью уточнения этиологической структуры инфекционно- воспалительного процесса в эндометрии проведено комплексное исследование микроценоза влагалища, цервикального канала и полости матки (биоптата эндометрия) у пациенток обеих групп.

Состояние микробиоценоза оценивали при комплексном микробиологическом исследовании с помощью микроскопии мазков, окрашенных по Граму, культуральном исследовании, а также молекулярно-биологическом исследовании ДНК генитальных инфекций методом ПЦР-диагностики. С учетом дизайна исследования, особенности забора материала, заключались в исключении контаминации биоптата эндометрия микрофлорой нижних отделов гениталий. С этой целью последовательно проводили обработку различных локусов антисептиком (октенисептом): после взятия на исследование вагинального отделяемого обрабатывали влагалище, шейку матки, а затем цервикальный канал (дважды с помощью бактериологическго тампона, смоченного антисептиком, с интервалом 5 минут). Контроль стерильности цервикального канала проводили посредством культивирования отделяемого цервикального канала в аэробных и анаэробных условиях.

При проведении микроскопии материал для исследования (вагинальное отделяемое, содержимое цервикального канала, фрагменты биоптата эндометрия) окрашивали по Граму и исследовали под микроскопом при увеличении с иммерсией, а также проводили

культуральное исследование в аэробных условиях и при пониженном содержании кислорода в атмосфере СО_2. При микроскопии состояние микробиоценоза оценивали по совокупности признаков: наличие лейкоцитарной реакции; характер эпителия; качественный и количественный состав микрофлоры.

Материал для бактериологического исследования из цервикального канала и полости матки получали с помощью специальных одноразовых стерильных инструментов (скринет и эндобраш, производство фирмы HARMA-MED Inc.).

Содержимое цервикального канала и гомогенизат биоптата эндометрия наносили на набор стандартных питательных сред и культивировали в аэробных, анаэробных условиях и условиях пониженного содержания кислорода.

Посев на кокковую флору проводили на молочнокислый агар (для выделения штаммов стафилококка) и на кровяной агар (для обнаружения стрептококка), на среду Эндо и Расселя - для выявления кишечной флоры.

Генитальные микоплазмы (Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum) выделяли с помощью тест системы «Mycoplasma DUO» («BIORAD»). Инкубация сред проводилась при температуре 37°С в течение 18 часов. Микроаэрофилы (гарднерелла, лактобацилы) выращивали в условиях пониженного содержания кислорода в атмосфере СО₂ в эксикаторе. Строгие анаэробы культивировали с использованием строгой анаэрбной техники: в анаэробной камере в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси (N₂ – 80%, CO₂ – 10%, H₂ – 10%).

Выделенные микроорганизмы идентифицировали по видовому

составу, определяли их количество в пересчете на 1 мл пробы (КОЕ/мл) и определяли чувствительность к антибиотикам диско-диффузным методом (10 дисков).

Результаты интерпретировали по общепринятым методикам с учетом рекомендаций, приведенных в Приказе МЗ России от 22.04.1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ».

Исследования по выявлению ДНК хламидий, генитальных уреаплазм, микоплазм, вируса простого герпеса I и II типов, цитомегаловируса, вируса папилломы человека осуществлялись на основе метода ПЦР - диагностики и проводились в лаборатории молекулярной диагностики в соответствии с «Методическими рекомендациями по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции» (ГК СЭН, 1995).

Материалом для ПЦР-исследования служили соскобы эпителия цервикального канала, нативного биоптата эндометрия, взятые отдельными одноразовыми, стерильными зондами, в соответствии с дизайном исследования, которые помещались в одноразовые пробирки с транспортной средой и доставляли для изучения [Херрингтон С., Макги Дж., 1999].

Выделение ДНК из клинического материала. В подготовленный лизирующий раствор вносили по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО, если он был предусмотрен для анализа данного вида инфекции), затем по 100 мкл проб. В пробирку отрицательного контроля (OK) выделения вносили 100 мкл отрицательного контрольного образца (ОКО). Пробы тщательно центрифугировали и прогревали. В каждую пробирку добавляли ресуспендированый на центрифуге сорбент, еще раз перемешивали и оставляли на 5 мин. Сорбент осаждали центрифугированием, супернатант удаляли в колбу-ловушку. В пробы добавляли по 500 мкл растворителя для отмывки, перемешивали до

полного ресуспендирования сорбента и центрифугировали с последующим удалением супернатанта, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. Отмывку повторяли дважды – супернатант удаляли полностью. Пробирки помещали в термостат при t 65 °С на 5-10 минут для подсушивания сорбента, затем добавляли по 100 мкл ТЕ-буфера для эллюции ДНК. Перемешивали, вновь помещали в термостат при t 65 °С на 5 минут, периодически встряхивая. Пробирки центрифугировали – супернатант содержал очищенную ДНК, пробы подготовлены к постановке ПЦР.

Постановка ПЦР. В работе были использованы ПЦР-тест-системы АмплиСенс-100-R (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ, г. Москва) для определения HPV 6/11, 16/18, 31/33, Chlamydia trachomatis, CMV-500, HSV-430 I,II, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum. В пробирки с ПЦР-смесью-1 и воском для амплификации вносили по 10 мкл ПЦР-смеси- 2, сверху добавляя по капле масла для ПЦР. В подготовленные для ПЦР пробирки под масло вносили 10 мкл ДНК, выделенной из клинических проб. Для контролей этапа ПЦР использовали отрицательный контроль (К-

) – в место ДНК-пробы вносили 10 мкл ДНК-буфера, и положительный контроль (К+) – вносили 10 мкл положительного контрольного образца ДНК (ПКО). Запускали на амплификаторе («MiniCycler», MJ Reseach) соответствующую определяемой инфекции программу.

Электрофоретический анализ продуктов амплификации. В подготовленный рабочий электрофорезный буфер вносили агарозу, до полного растворения плавили в микроволновой печи, остужали до 65-70°С. В форму камеры для горизонтального электрофореза (SE-2, «Хеликон») заливали расплавленный гель, толщиной около 6 мм. После полного застывания подложку с готовым гелем помещали в камеру с расположением лунок ближе к отрицательному электроду. Из пробирок с

продуктами амплификации вносили по 10 мкл пробы в лунки геля. Соблюдая полярность (ДНК движется к положительному электроду), подключали камеру к источнику тока с напряжением 10 В/см геля. После прохождения красителем половины длины геля, источник тока выключали, гель переносили на трансиллюминатор, получали изображение геля на компьютере с помощью видеосистемы, формировали базу данных.

Учет результатов. Учет результатов ПЦР-анализа проводился по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК. При проведении оценки результатов анализа, проходящего с применением ВКО, учитывались следующие параметры:

- в дорожке, соответствующей ОК этапа выделения, была только полоса ВКО;

- в дорожке положительного контроля этапа ПЦР определялась только полоса К+;

- в дорожке К- этапа ПЦР не было никаких полос за исключением прайс-димеров, находящихся на уровне ниже 100 п.н.

При проведении учета результатов исследований, проведенных без применения ВКО, оценивались: в дорожке, соответствующей К+ этапа ПЦР, была яркая специфическая светящаяся оранжевая полоса на уровне фрагмента ДНК возбудителя; в дорожке ОК этапа выделения и К– этапа ПЦР не было никаких полос.

Положительными считались образцы, которые содержали специфическую светящуюся полосу большей или меньшей интенсивности на уровне фрагмента ДНК возбудителя.

Отрицательными – образцы, не содержавшие никаких полос.

Для проведения твердофазного иммуноферментного анализа определения антител класса IgG и IgM к антигенам ВПГ I, II типов и ЦМВ использовали стандартные коммерческие наборы реагентов компании

«Протеиновый контур» (г.

иммуноглобулинов один тип моноклональных антител против ВПГ I, II типов и ЦМВ иммобилизировали на внутренних поверхностях ячеек планшетов для микротитрования. Другой тип моноклональных антител к независимому эпитопу молекул иммуноглобулинов применялся в виде конъюгата с биотином. Индикаторным компонентом реакции являлся конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином, имеющим высокое сродство к биотину. После стандартного режима инкубации образцов сыворотки крови с моноклональными антителами, и последующих промывок в лунки микропланшета вносили конъюгат пероксидазы со стрептавидином, вновь инкубировали, и добавляли субстрат с реагентом цветной реакции (3-диметиламинобензоат). После развития окраски измеряли активность связанной пероксидазы с использованием фотометра для микропланшета с длиной волны 450 нм. В качестве стандарта для сравнения в каждой реакции служили рекомбинантные образцы, входящие в состав наборов. По данным титрования стандартных образцов строили калибровочные графики, по которым определяли концентрацию иммуноглобулинов в опытных образцах [39].