Морфологические и иммуногистохимические методы исследования

Материал для морфологического и иммуногистохимического исследования получали с информированного добровольного согласия на участие в исследвании как в ходе операции влагалищным доступом по поводу ПТО, так и при выполнении гистероскопии, раздельного выскабливания слизистой матки и / или ножевой биопсии шейки матки и других инвазивных манипуляции по поводу различной гинекологической патологии.

Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине с фосфатным буфером, обрабатывали в аппарате гистологической проводки тканей фирмы «Pool Scientific Instruments» (Швейцария) и заливался в парафин. Суммарное время фиксации, проводки и заливки материала, как правило, не превышало 48 часов.

Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование выполняли на биоптатах передней и задней стенки влагалища от 168 пациенток с пролапсом и без пролапса гениталий.

ИГХ реакции проводили на депарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм расположенных на стеклах, покрытых APES - слоем (Janice A., 1983). Неокрашенные срезы от каждого случая обрабатывали с помощью стандартного микроволнового метода иммуногистохимии. Демаскировку антигенов для ИГХ проводили в микроволновой печи. Стекла погружали в цитратный буфер (рН 6,0) и нагревали в микроволновой печи в течение 15 минут при мощности 600 Вт. Далее стекла остывали 20 минут при комнатной температуре. Остывшие стекла помещали во влажные камеры (для предотвращения высыхания срезов) и инкубировали 15 минут с 3% раствором Н₂О₂. После обработки перекисью стекла ополаскивали в фосфатном буфере (рН 7,0-7,6). Далее стекла инкубировали с 1% раствором альбумина во влажных камерах в течение 30 минут. По окончании инкубации излишки альбумина аккуратно стряхивали со стекол и наносили первичные антитела при помощи микропипетки. В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела к фибулину 5 (Abbiotec, 1:100), лизилоксидазаподобного белка 1 (LOXL1) (Abbiotec, 1:100), ММР-2 (LabVision, ready-to-use), MMP-9 (LabVision 1:50) и TIMP-2(LabVision, ready- to-use). Срезы инкубировали с первичными антителами от 30 минут до 1 часа, в зависимости от времени воздействия, предусмотренного в спецификации к антителу от фирмы производителя. Далее срезы отмывали в фосфатном буфере (рН 7,0-7,6) от первичных антител, не связавшихся с эпитопами и обрабатывали вторичными антителами.

Для ИГХ реакций ставили положительные и отрицательные контроли. В качестве отрицательных контролей брали образцы исследуемых срезов, которые подвергались стандартной процедуре иммуногистохимии, но без добавления первичных антител. Положительные контроли для каждого антитела выбирали в соответствии со спецификациями от фирмы производителя.

Проводилась полуколичественная и количественная оценка результатов реакций. Результаты ИГХ реакции для исследуемых антител оценивали полуколичественным методом в баллах по количеству позитивно окрашенных клеток, причем отдельно оценивали эпителиальные клетки, фибробласты, эндотелий сосудов и строма, если продукт реакции выявлялся в указанных выше структурах. Оценку интенсивности реакции проводили по 6-ти балльной системе: 2 балла - до 20% окрашенных клеток; 4 балла - от 20 до 40% окрашенных клеток; 6 баллов - более 40% окрашенных клеток.

2.3