Морфологическое и иммуноморфометрическое исследование эндометрия

Морфологические и иммуноморфометрические исследования проводили в Московском городском центре патологоанатомических исследований при Городской клинической больнице № 14 им. проф.

Материалом для исследования являлись биоптаты эндометрия, полученные в амбулаторных условиях при помощью аспирационной

кюретки Pipelle de Cornier (Франция). Из соскобов выбирали фрагменты эндометрия, фиксировали их в 10,0% растворе нейтрального формалина в течение 24 часов. Далее образцы тканей заливали в парафиновые блоки (точка плавления 54-56°С), готовили микротомные срезы толщиной 5-7 микрон, которые после стандартных гистологических проводок окрашивались гематоксилином и эозином, а также пирофуксином по Ван Гизону. После гистологического просмотра препаратов отбирали блоки с париетальным и базальным эндометрием. Из отобранных блоков готовили серийные срезы, которые размещали на покрытых адгезивом стеклах.

При световой микроскопии микропрепаратов выявлялись изменения в пределах эндометрия и пограничных слоях миометрия. Особое внимание уделялось наличию в эндометрии воспалительных инфильтратов, состоящих преимущественно из лимфоидных элементов с примесью макрофагов, наличию плазматических клеток, очаговому фиброзированию стромы, склеротическим изменениям стенок спиральных артерий.

Для иммуноморфологического исследования маркеров воспаления, ангиогенеза, апоптоза, пролиферации клеток и рецепторов эстрогенов и прогестерона использовали иммунопероксидазный метод с применением первичных специфических моноклональных антител.

Гистологические срезы толщиной 4-5 мкм, изготовленные из парафиновых блоков с помощью микротома «Leica» (Germany) помещали на покрытые специальным адгезивом (APES-ацетон) предметные стекла.

В качестве первичных антител для иммуногистохимического исследования использовали моноклональные антитела (производства DAKO, Дания, Германии, Lab Vision, США) к фактору некроза опухолей

альфа (TNF-α), трансформирующему фактору роста бета (TGF-β), сосудисто-эндотелиальному фактору роста (VEGF, клон G153-694), маркеру пролиферирующих клеток ядерному белку Ki-67 (Ki-67, клон PC- 10), ингибитору апоптоза Всl-2 (клон 124), индуктору апоптоза Вах (клон D0-7), эстрогеновому рецептору (ER, клон 1D5), прогестероновому рецептору (PgR, клон PgR 636), иммуноглобулинам класса М (Ig M), иммуноглобулинам класса G (Ig G) для выявления плазмобластов и плазматических клеток, маркеру макрофагов.

После инкубации гистологических срезов с первичными антителами (рабочее разведение антисывороток – 1:50-100, время инкубации – 45-60 мин при температуре 37ºС), их обрабатывали вторичными биотилированными антикроличьими иммуноглобулинами.

Для последующей визуализации результата реакции связывания антигена с антителом использовали систему детекции «Ultra Vision LP Value HRP Polymer» (Lab Vision, США). Применяли фермент (пероксидазу хрена) в присутствии субстрата (перекиси водорода) и специального реактива (3,3- диаминобензидин).

Конечный продукт реакции представляет собой мелкие коричневатые гранулы в участках локализации антигена. Для таких антигенов, как Ki-67, это – ядра клеток, для других – цитоплазма и/или клеточные мембраны клеток, в определенной мере - экстрацеллюлярный матрикс.

Проводили общепринятые отрицательные и положительные контрольные процедуры на используемые реагенты и ткани при обработке параллельных срезов. Отрицательный контроль заключался в проведении реакции с исключением первичных, специфических антител (путем их замены неиммунным реактивом – бычьей сывороткой) или специфических антигенов.

После проведения иммунопероксидазной реакции гистологические препараты докрашивали гематоксилином, изучали и фотографировали, используя световой микроскоп DM-LB («Leica», Германия) с цифровой фотокамерой «Olympus» (Япония).

Морфометрический метод. Результаты иммуногистохимических реакций оценивали с помощью полуколичественного морфометрического метода [172]. Вычисляли среднее число плазмобластов и плазмоцитов, экспрессирующих IgM и IgG, число макрофагов в 10 полях зрения при увеличении микроскопа х120; процент клеток, ядра которых экспрессируют белок Ki-67 в 10 полях зрения при увеличении микроскопа х 120. Применяли балльную систему для оценки экспрессии TNF-α, TGF-β, VEGF, Вах и Bcl-2. Визуально оценивали интенсивность окраски клеток в баллах от 0 до 3 (отрицательная, слабая, умеренная и выраженная окраска) и подсчитывали процент позитивно окрашенных клеток при каждом значении интенсивности окраски (10 полях зрения при увеличении микроскопа х 120).

Коэффициент экспрессии рассчитывали для каждого наблюдения по формуле [172]:

∑ (Б х П)

К = ,

100

где Б – интенсивность окраски в баллах (от 0 до 3-х), П – процент окрашенных клеток (от 0 до 100%) при каждом значении Б.

Для оценки экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона использовали количественный метод с подсчетом Histochemical score (H.S.), разработанный McCarty и соавт. (1985). Система подсчета включала интенсивность иммуногистохимической окраски, оцениваемой по 3- бальной шкале и процент окрашенных клеток, и представляла собой сумму произведений процентов, отражающих долю клеток с различной

интенсивностью окраски на балл, соответствующий интенсивности реакции. Подсчет проводился в трех когортах по 100 опухолевых клеток в различных полях зрения объективом х40. Интенсивность окраски оценивалась следующим образом: 0 - нет окрашивания, 1 - слабое окрашивание, 2 - умеренное и 3 - сильное окрашивание. Формула подсчета:

H-score = ∑ P_i х i,

где P_i - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью, i -

интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0 до 3.

О степени экспрессии стероидных гормонов судили по результату H- score: 0-50 - отрицательная, 51-100 - низкая, 101-200 - умеренная и 201 и более - высокая. Данные результаты опубликовани [43].