Биохимические и микробиологические основы получения витамина В12 с помощью метанообразующих бактерий

Отсутствие доступных методов химического синтеза витамина В₁₂ явилось причиной интен­сивных поисков его природных источников. Эта работа проводилась в лаборатории витаминов

Института биохимии им.

Одновременно в литературе появились сообщения об обнаружении В₁₂-подобных соединени в иле городских сточных вод и в сточных водах некоторых промышленных предприятий, ПОДВЄ1 гнутых анаэробной очистке в метантенках.

Все эти данные явились основой для изучения возможности использования процесса анаэробш го разложения сложных органических субстратов, называемого метановым брожением, для наг равленного биосинтеза витамина В₁₂ на доступных питательных средах.

Для решения этого вопроса прежде всего было необходимо подобрать сырье, отвечающее след? ющим требованиям:

• содержать основные компоненты, необходимые для развития микроорганизмов;

• не иметь примесей, которые препятствовали бы получению кормовых препаратов;

• быть достаточно массовыми, чтобы обеспечить биосинтез витамина В₁₂ в количествах необходимых для полного удовлетворения потребностей народного хозяйства.

Перечисленным условиям наиболее соответствовали отходы (барда) ацетоно-бутиловых и спир товых заводов, перерабатывающих зерно и мелассу. Эти отходы являются массовыми (до 10 млн м в год), содержат достаточные количества углеводов, азотсодержащих органических соединени: и минеральных компонентов.

Важным этапом был подбор культур, вызывающих метановое брожение этих субстратов. Выбо был остановлен на биоценозе бактерий, осуществляющих термофильное метановое брожени сточных вод, так как при высоких температурах интенсивность процесса возрастает в два-три ра за.

Изучение развития данного биоценоза показало, что метановое брожение вышеуказанных суб стратов можно рассматривать как процесс, состоящий из двух фаз: в первой фазе происходит сбра живание углеводов, аминокислот, пептидов и белков; во второй фазе — сбраживание образовав шихся ранее жирных кислот и низших спиртов до метана и углекислоты (рис. 1).

Первая фаза брожения протекает при pH от 5,0 до 6,5-7,0 и характеризуется интенсивным раз витием углеводсбраживающих и аммонифицирующих бактерий, максимальное количество ко торых достигает в это время 1 млрд клеток на 1 мл.

Остальные физиологические группы бактерий (разрушающие клетчатку, сульфатвосстанавли вающие и метанообразующие) достигают интенсивного развития лишь по мере перехода брожени? в щелочную фазу, которая характеризуется изменением pH от нейтрального (7,0) до слабощелоч ного (8,5). Доминирующей группой в этот период становятся метанобразующие бактерии

Динамика развития физиологических групп бактерий, осуществляющих анаэробный распад ве ществ барды, коррелирует с газообразованием. Если в кислой фазе брожения количество выделивше

Рис. I. Изменение биохимических показателей ацетоно-бутиловой барды в процессе созревания метанового биоценоза а; 1 - летучие жирные кислоты.; 2 - углеводы; 3 - общая кислотность; 4 - pH б— 1 - общий азот; 2 - небелковый азот; 3 - белковый азот; 4 — аммиачный азот; 5 - летучие кислоты: 6 - pH; в: } - бактериальные клетки; 2 - сухие вещества; 3 - углеводы; 4 - аммиачный азот

Бы-ховский В.Я. Промышленные способы получения витамина В₁₂ и его коэнзимной формы

гося газа составило в среднем 0,2 объема на объ­ем бродящего субстрата в сутки, то в щелочной период количество газа возрастает до двух объ­емов на объем субстрата. Максимум образова­ния газа совпадает с максимальным развитием метанообразующих бактерий.

Развитие термофильных бактерий, сбражи­вающих углеводы, сопровождается уменьше­нием содержания углеводов в культуральной жидкости, возрастанием титруемой кислотнос­ти и общего количества летучих жирных кис­лот (рис.2, а). Накопление последних обуслов­лено также и деятельностью аммонифициру­ющих бактерий, осуществляющих протеолиз белков и пептидов и дезаминирование амино­кислот. Эти процессы протекают столь интен­сивно, что практически весь белковый азот суб­страта превращается в аммиачный (рис.2, б).

В кислой фазе брожения метанообразу­ющих бактерий практически нет; количество их уменьшается после инокуляции с сотен ты­сяч до сотен клеток на 1 мл и остается неиз­менным в течение первой фазы. Развитие этих бактерий возобновляется по мере нейтрализа­ции среды и достигает максимума (1 млрд кле­ток на мл) в щелочной фазе. Размножение ме- танобразующих бактерий сопровождается уменьшением содержания летучих жирных кислот и обильным выделением газа. Если не вносить новых продуктов первой фазы броже­ния, то по мере истощения в среде летучих жирных кислот количество метанобразующих бактерий уменьшается на 2—3 порядка — до миллиона клеток на 1 мл. Однако путем регу­лирования скорости введения свежего суб­страта можно добиться такого соотношения

Рис. 2. Изменение состава среды под влиянием развития уг- леводсбражиоающих (а) и аммонифицирующих (б) бактерий А: 1 - углеводы; 2 - летучие жирные кислоты; 3 - титру­емая кислотность; 4 - углеводсбраживаемых;

Б: 1 — небелковый общий азот; 2 - небелковый органический азот; 3 - аммонийный азот; 4 - летучие жирные кислоты; 5 — аммонифицирующие бактерии

происходящих процессов, при котором метановое брожение будет протекать непрерывно.

Из результатов исследований видно (табл. 1), что при термофильном метановом брожении (53 °С) ацетоно-бутиловой и мелассной спиртовой барды происходит образование витамина В₁₂.

Однако установления этого факта было еще недостаточно, поскольку витамин В₁₂ представлен не индивидуальным веществом, а группой корриноидных соединений. В тоже время активными для человека и животных являются лишь аналоги, содержащие производные бензимидазола, -5,6- диметилбензимидазол (истинный витамин В₁₂) и 5-оксибензимидазол (фактор III).

Поэтому изучение состава кобамидов, образующихся при метановом брожении ацетоно-бутило­вой и спиртовой барды, представляло первостепенный интерес. Данный процесс можно было реко­мендовать для промышленного использования лишь при наличии высокого уровня биосинтеза би­ологически активных форм витамина В₁₂.

С этой целью витамин В₁₂, выделенный из биомассы бактерий, был подвергнут электрофорети­ческому и хроматографическому исследованию. Результаты исследования приведены в табл. 2.

Табл. 1. Образование витамина В_{2 при метановом брожении спиртовой мелассной барды

Табл. 2. Относительное содержание аналогов витамина В₁₂, синтезируемых при термофильном метановом брожени ацетоно-бутиловой и спиртовой барды, в % от суммы

Из данных, приведенных в табл.

Высокое содержание биологически активных форм витамина В₁₂, синтезируемых при термо фильном метановом брожении ацетоно-бутиловой и спиртовой барды, поставило задачу совершеї ствования процесса с целью получения высокого и стабильного ваыхода витамина. Исходя из это; цели, были проведены исследования по выяснению основных продуцентов витамина В₁₂ среди ело» ного биоценоза бактерий, осуществляющих анаэробный распад указанных субстратов (рис. 3).

Оказалось, что в первой фазе процесса накопление витамина В₁₂ идет очень слабо. Первоначал! ное содержание его (130 мкг/л) определяется количеством, которое вносится с инокулятом, а таг же находится в барде. По мере развития аммонифицирующих бактерий происходит некоторое уве личение количества витамина В₁₂ (до 600 мкг/л)

Только с размножением метанобразующих бактерий начинается быстрое накопление витамин В₁₂. Максимум синтеза кобамидов (2200 мкг/л) совпадает с наивысшим количеством метанобразх ющих бактерий.

Таким образом, можно считать установленным, что основными продуцентами витамина В, в сложном биоценозе, осуществляющем анаэробный распад органических веществ, являются ме танобразующие бактерии, которые синтезируют витамина в 4—5 раз больше, чем другие микроор ганизмы этого сообщества. Высокое накопление витамина В₁₂ бактериями данной группы связан с функцией этого витамина в жизнедеятельности клеток.

Обнаруженная корреляция между развитием метанобразующих бактерий и накоплением витамин; В₁₂ позволила значительно повысить выход витамина путем создания преимущественных условий дл. развития данной группы микроорганизмов.

Известно, что метанобразующие бактерии для своего развития требуют специфических субстра тов, к которым относятся низшие жирные кислоты и низшие спирты. Добавление названных суб стратов к барде должно было бы обеспечить пре имущественное развитие метанобразующих бак терий, а увеличение их численности привесті к большему накоплению витамина В^.

Рис. 3. Изменение содержания витамина В^и состава микрофлоры в процессе развития метанового биоценоза 1 - витамин В_}2в культуральной жидкости; 2 - вита­мин В]2 в фильтрате культуральной жидкости; 3 - угле- водсбраживающие бактерии; 4 -• аммонифицирующие бактерии; 5 - метанобразующие бактерии

Проведенные эксперименты подтвердили ЭТ( предположение. Ниже показано влияние ряда ие следованных субстратов на биосинтез витамин, В₁₂ при метановом брожении ( опыты проводи ли на ацетоно-бутиловой барде с добавление: СоС1₂ • 6Н₂О — 5 мг/л).

Из представленных данных (табл. 3) видно что добавление низших жирных кислот и спирте: во всех случаях приводило к повышению биосин теза витамина Bj₂. Особенно выход витамина бы велик при добавлении уксусной кислоты и мет;: нола.

Применение метанола, обеспечивающего пре обладающее развитие метанобразующих бают рий, резко повысило эффективность разрабаты­ваемого метода. Добавление метанола дало пяти

Табл. 3. Влияние этилового и метилового спиртов на качественный состав кобамидов, синтезируемых при метановом брожении ацетоно-бутиловой барды, % от суммы

Исследуемые спирты добавляли в количестве 0,5 % об./об.

шестикратное увеличение выхода витамина B_i2 и, кроме того, позволило стабилизировать процесс брожения, что является одним из важнейших условий промышленного производства.

Высокое содержание витамина В₁₂ в культуральной жидкости в случае применения метанола позволило рекомендовать данный процесс для промышленного получения этого витамина.

1.2.