<<
>>

Использование биокатализаторов

Замена минеральной кислоты на ферменты основана на специфичности действия ферментов, что до­лжно позволить достичь большей глубины гидролиза пектинсодержащих компонентов сырья, что авто­матически приведет к повышению выхода продукта из единицы массы сырья.

Это же свойство фермен­тов должно свести к минимуму деградацию непектиновых компонентов сырья, что приведет к облегче­нию диффузионного выхода высвобожденного пектина за пределы границ частички сырья, а также к упрощению процесса разделения отработанной сырьевой массы и жидкой фазы реакционной смеси.

Использование ферментов микроорганизмов насчитывает несколько веков: это процессы пи­воварения, сыроделия, хлебопечения. Традиционные технологии, в основе которых лежат фер­ментативные процессы и биохимические превращения, характерные, например, для ферментов дрожжей и солода, использовались задолго до того, как стал известен механизм действия этих фер­ментов. Однако только благодаря достижениям науки в области энзимологии стало возможным промышленное получение и применение микробных ферментных препаратов в различных отрас­лях пищевой промышленности.

Промышленный биосинтез карбогидраз послужил основанием для их использования в процес­сах получения простых сахаров путем осахаривания отходов пищевых производств. Важный аспект применения препаратов карбогидраз и комплексных препаратов, разрушающих клеточную стенку растений, использование их для выделения ценных пищевых веществ из растительного сырья. Как за рубежом, так и в нашей стране известны способы применения таких препаратов для извлечения различных ценных компонентов из зеленого и черного чая: аминокислот, углеводов, таннина, сапонинов, кофеина, ароматических веществ.

В России предложены способы применения ферментных препаратов, включающих карбогид- разы и пектиназы, для получения агара из морских водорослей. Сущность способа заключается в разрушении и удалении межклеточных веществ и структурных элементов, что позволяет полу­чить агар с сохранением его природных свойств, а также продукты на его основе.

За рубежом и в нашей стране используют карбогидразы в композиции с протеазой для разруше­ния клеточной стенки бобов, сои, гороха ферментами из микроорганизмов. Помимо разрушения клеточной структуры бобовых культур осуществляется протеолиз, т.е. гидролиз белка до низкомо­лекулярных растворимых форм. Суммарное действие ферментов приводит к увеличению выхода белка из растительного сырья.

Рассмотрим ферменты, которые могут быть использованы в гидролизе пектинсодержащего сырья. Преимущества применения ферментов для гидролиза протопектина очевидны: незначи­тельная концентрация ферментов способствует взаимодействию огромного количества по отноше­нию к ним реагирующих веществ. По сравнению с кислотным гидролизом ферментативный проис­ходит в более мягких условиях pH и t", оптимальных для действия ферментов, и ведет к почти ко­личественному выделению пектина; значительно упрощается аппаратурное оформление производ­ства и снижаются энергозатраты.

Действие большинства ферментов пектолитического действия хорошо описано в научно-техни­ческой литературе, изучен механизм действия, определены оптимальные параметры действия.

Например, пектинэстераза (РЕ) гидролизует сложноэфирные связи в молекуле пектина, отщеп­ляя метоксильные группы с образованием метилового спирта и полигалактуроновой кислоты. Оптимальные условия действия: pH 3,5-4,2; t — 40 °С.

Полигалактуроназа (PG) катализирует гидролиз галактуронидов различной степени этерифи­кации по гликозидным связям. Это приводит к снижению молекулярной массы продукта. Опти­мальные условия действия: pH 3,5-5,0; t — 52 °С.

Пектатлиазы (РА) деградируют низкоэтерифицированные молекулы пектина, а пектинлиазы (PL) расщепляют высокометоксилированный пектин.

Учитывая, что часть пектиновых веществ находится в сырье в связанном виде, в том числе вхо­дит в структуру арабано-галактанового комплекса и амилопектина, а также химически связана с полисахаридами клеточной стенки растений (целлюлозой, ксиланами, глюканами и другими гемицеллюлозами), в пектиновой технологии целесообразно использование ферментов карбогид- разного действия.

С другой стороны, для разрушения пектиновых веществ с высокой молекулярной массой (нера­створимый пектин) целесообразно использование препаратов протопектиназы — комплекса фер­ментов, включающего пектин — и пектаттрансэлиминазы (лиазы).

По современным представлениям комплекс карбогидраз включает различные по механизму действия ферменты. Основные из них: целлюлаза, ксиланаза, арабиназа, галактаза, глюканаза, амилаза. По механизму действия они делятся на эндо- и экзоферменты. Изучение ферментов кар- богидразного комплекса, полученных с использованием различных продуцентов рода Trichoderma, Aspergillus и др., позволило выявить их общее свойство: молекулярная масса в преде­лах 12 000-47 000, изоэлектрические точки в пределах 3,3-5,8. Близкими по своим значениям яв­ляются кинетические константы и специфичность отдельных ферментов комплекса к различным субстратам. Однако выделенные в чистом виде ферменты различаются физико-химическими пока­зателями: pH, термостабильностью, оптимальными условиями действия и др.

Ферментативный гидролиз целлюлозы происходит в результате последовательно-параллельно­го действия некоторых ферментов, входящих в состав целлюлазного комплекса. В первую очередь, на нативную целлюлозу действует эндоглюканаза, которая разрушает ее структуру и переводит в растворимые производные, вслед за этим ферментом в реакцию вступает экзоглюканаза, катали­зирующая гидролиз аморфной целлюлозы до растворимых продуктов, далее целлобиаза участвует в гидролизе концевой целлобиозы до глюкозы.

Гемицеллюлозы принадлежат к группе гетерополисахаридов и состоят из остатков различных моносахаридов и их производных.

Механизм действия ферментов в процессе расщепление гемицеллюлоз включает в себя такие стадии, как превращение высокомолекулярного нерастворимого в воде глюкана в водораство­римые гуммиподобные вещества более низкой молекулярной массы, последующее расщепление их до дисахаридов, а затем до моносахаридов или их производных.

Глубина ферментативного гидролиза всего комплекса гемицеллюлоз зависит от состава фермен­тов, т.е.

от наличия всех составляющих гемицеллюлазного комплекса: ксиланазы, глюканазы и др. Ксиланазный комплекс включает ферменты эндо- и экзо действия, расщепляет ксилан до моносаха­ров. В случае действия глюканаз конечным продуктом гидролиза является глюкоза. Микробными продуцентами гемицеллюлаз являются микроскопические грибы рода Aspergillus (виды огугае, batatae, niger), а также Trichoderma (виды viride, terreus, lignorum, roseum). Гидролитические про­цессы в результате действия гемицеллюлаз, целлюлаз и амилаз приводят к модификации раститель­ного сырья, изменяя состав клеточной стенки растений и обогащая раствор простыми сахарами.

Под действием ферментов класса гидролаз, к которым относится карбогидраза, реакция гидро­лиза протекает по следующей схеме:

Процесс ферментативного гидролиза проходит через образование фермент-субстратного ком­плекса, далее через внутримолекулярную перегруппировку с присоединением молекулы воды под влиянием активного центра фермента и затем выделение из фермент-субстратного комплекса про­дуктов реакции. Специфичность действия ферментов напрямую связана с химической природой субстратных фрагментов Rj и R2. Рассмотрим схему действия различных ферментов, например, на пектиновую молекулу (рис. 6).

Аналогично можно представить расщепление связей между пектиновыми веществами и геми­целлюлозой. Ферменты такого класса не действуют на полигалактуроновую кислоту, но активно способствует разрушению межмолекулярных связей.

Коммерческие ферментные препараты микробного происхождения редко обладают какой-либо одной каталитической активностью, поэтому требуется их комплексная проверка. Для такой про­верки были выбраны 5 ферментных препаратов, полученных биосинтезом с различными продуцен­тами, и была исследована их каталитическая активность.

Результаты представлены в табл. 3.

Первый шаг поиска включает проверку индивидуальных ферментных препаратов на действие по высвобождению пектина из сырья. Для этого было выбрано яблочное сырье — высушенные вы­жимки после получения сока. Стандартный анализ* на содержание пектина в сырье показал, что оно составляет 10,2 % от массы сырья.

Стандартный анализ включал в себя: гидролиз сырья в присутствии азотной кислоты (pH 2,0; t = 95 °С) отфильтровывание отработанной массы, осаждение пектина спиртом, сушка осадка и взвешивание. Понятно, что аналитическая методика целиком повторяет традиционную техноло­гию пектина. Учитывая, что ферментативный гидролиз может освободить больше пектина по сравнению с кислотным, общий выход пектина может быть больше 100 % .

Для проверки были выбраны следующие условия, одинаковые для всех ферментных препара­тов: доза препарата — 0,2 % к массе сухого сырья, гидромодуль (соотношение массы воды к массе сырья) — 10: 1, продолжительность гидролиза — 3,0 ч, кислотность раствора устанавливалась са­мопроизвольно, температура поддерживалась в пределах рекомендованного оптимума. Резуль­таты проверки представлены в табл. 4.

Перспективными для составления МЭК показали себя пектинлиаза Bacillus macerans и обе кар­богидразы. Из этих препаратов и были на втором шаге поиска испытаны две композиции:

композиция №1 — пектинлиаза Bacillus macerans и карбогидраза Trihoderma reesei; композиция №2 — пектинлиаза Bacillus macerans и карбогидраза Bacillus subtilis.

На рис. 8 показана динамика накопления пектина в реакционной среде при использовании двух МЭК.

С точки зрения выхода пектина, лучшей является МЭК 1, в которой проявляется наибольшая эффективность действия ферментов. С точки же зрения практической, МЭК 2 более перспективна, поскольку оптимальные области pH действия входящих в нее ферментов близки, и в будущем про­изводстве можно отказаться от корректировки кислотности реакционной среды в ходе гидролиза.

Из зависимостей на рис.

7 становится очевидной и продолжительность ферментативного гидро­лиза — не более 3,5 ч.

Табл. 3. Каталитическая активность исследуемых ферментных препаратов

п/п

Ферментный препарат, проду- цент, оптимальные пара­метры действия Каталитическая активность, ед./ч
Пектин­

лиазная

Карбо­

гидразная

Эндополига­

лактуроназная

Пектин­

эстеразная

1. Карбогидраза, Trichoderma reesei, pH 4,5-5,0; t = 55 "С 0 7600 4,4 0
2 Карбогидраза,

Bacillus subtilis, pH 5,5—6,0; t = 62‘C

0 1030 4,3 0
3 Комплексный препарат, Bacillus subtilis и Penicillium emersonii, pH 4,5-6,0; t = 62'C 11400 2600 4,8 0
4 Пектинлиаза,

Bacillus macerans, pH 6,0; t = 40 'C

44680 540 0 0
5 Амилопектинлиаза,

Penicillium, pH 3,2; t = 38'C

0 0,5

*Каталитическая активность ферментных препаратов определялась по стандартным методикам:

• пектинлиазная — по расщеплению двойных связей между 4 и 5 атомами углерода в продуктах распада пектина;

• пектинэстеразная — по количеству освободившихся в результате гидролиза пектина карбоксильных групп;

• карбогидразная — по образованию восстанавливающих сахаров при гидролизе субстрат хроматографической бумаги; ■ эндополигалактуроназная — по снижению вязкости пектинового раствора за счет уменьшения молекулярной массы

пектина.

Табл. 4. Результаты гидролиза пектинсодержащего сырья с использованием различных катализаторов

п/п

Каталитический препарат Температура гидролиза, "С Кислотность экстракта, рн Выход пектина,

% к массе сырья

1 Карбогидраза Trichoderma reesei 50-60 4.5 11,0
2 Карбогидраза

Bacillus subtilis

60-70 3,3 10,7
3 Комплексный препарат Вас. subtilus и Penicillium 60-70 5,3 10,4
4 Пектиилиаза

Bacillus macerans

40-50 5,5 11,6
5 Амилопектинлиаза

Penicillium

35-45 2,8 8,4

Третьим шагом поиска является оптимизация параметров стадии гидролиза. Под параметра­ми, кроме продолжительности, понимаются:

• доза МЭК;

• величина гидромодуля;

• температура реакционной среды.

Доза МЭК. Доза МЭК представляет собой массовую долю ферментных препаратов при их паспо­ртной активности (табл. 3 в нашем случае) по отношению к массе сухого сырья. Она не должна быть очень велика, иначе ферментативный гидролиз проигрывает кислотному по стоимости, но и не может быть очень мала, иначе снижается выход продукта. На рис. 8 представлена зависимость относительного выхода пектина от дозы МЭК. Видно, что эта зависимость имеет экстремум, паде­ние величины выхода при избытке дозирования катализатора объясняется ускоренной деграда­цией уже освобожденного от сырья продукта, чего допускать нельзя.

Величина гидромодуля и температура среды. Если к сухому сырью добавить малое количес­тво воды, то вся она может расходоваться на гидратацию молекул компонентов сырья (процесс на­бухания), и свободной воды в реакционной массе не будет. Это резко осложнит как протекание ре­акции гидролиза, так и массоперенос освобожденного пектина из внутренних объемов частиц сырья. Таким образом, величина гидромодуля малой быть не может.

Рис. 7. Динамика накопления пектина в реакционной среде при каталитическом действии:

Рис. 8. Влияние дозы ферментного препарата ны выход пектина из сухих яблочных выжимок

Рис. 9. Влияние величины гидромодуля на концентрацию пектина в жидкой фазе и на распределение пектина между твердой и жидкой фазами реакционной массы

При избытке воды химическая реакция и массообмен интенсифицируются, но приходится на последующих стадиях технологической схемы перерабатывать значительные объемы раствора, что увеличивает производительность и капитальные затраты на оборудование. Необходим неко­торый компромисс.

После прохождения процесса гидролиза реакционная среда представляет собой двухфазную систему, в которой пористая твердая фаза насыщена пектином, выход которого во внешнюю жид­кую фазу затруднен внешним диффузионным сопротивлением. Величина этого сопротивления пропорциональна концентрации пектина в воде. При малом гидромодуле концентрация раствора пектина велика, поэтому значительная его часть застревает во внутреннем объеме частиц сырья, что хорошо видно из зависимостей (рис. 9). При величине гидромодуля 4:1 больше половины всего количества пектина остается внутри частиц сырья.

Дальнейшее разбавление среды снижает долю застрявшего пектина и при гидромодуле 14:1 прак­тически весь продукт выходит во внешнюю водную фазу, т.е. не удерживается частичками сырья.

Решающим обстоятельством всего этого распределения является то, что при ферментативном ка­тализе деградация целлюлозной основы сырья не происходит по причине избирательности каталити­ческой активности ферментов. Макроструктура частиц сырья не разрушается, каждая индивидуаль­ная частица сохраняет форму и четко определяемую границу между твердой и жидкой фазами, что и облегчает диффузионный переход молекул пектина из внутренних полостей наружу. Это обстоятель­ство является одним из основных преимуществ ферментативного гидролиза перед кислотным.

Таким образом, стадию гидролиза и экстракцию теперь можно осуществлять в один прием без слива жидкой фазы. В реактор загружается сухое сырье и заливается вода до гидромодуля 6:1. Смесь выдерживается при перемешивании при температуре 45 °С 0,5 ч для завершения процесса набухания, после чего в реактор вводится необходимая доза МЭК. Реакция гидролиза начинается при t = 45 °С, что является оптимальной температурой для действия пектинлиазы, затем ее подни­мают до уровня 60-65 °С, что стимулирует действие карбогидразы. Подъем температуры целесооб­разно совместить с доливом воды до величины гидромодуля 8:1.

После выдерживания реакционной смеси в течение 3—3,5 ч необходимо провести инактивацию ферментов. Это осуществляют добавлением горячей воды до величины гидромодуля 14:1 и повы­шением температуры до 85 °С. Для полного прекращения действия ферментов достаточно смесь вы­держать при этой температуре 15-20 мин.

2.2.2.

<< | >>
Источник: И.М. Грачева. Биотехнология биологически активных веществ. Учебное пособие для студентов высших учебных заведений./ Под редакцией д. б. н., проф. МГУШ1И.М. Грачевой ид.т.н., проф. МГУШІЛ.А. Ивановой. — М., Издательство НПО «Элевар»,2006. — 453 с.. 2006

Еще по теме Использование биокатализаторов:

  1. Физиолого-гигиеническое значение питательных веществ
  2. МИНЕРАЛЬНЫЙ ОБМЕН
  3. Кинетические исследования гидролиза ОБМ и EPeFRET (ОБМ81-103)
  4. Новая биотехнология пектина
  5. Использование биокатализаторов
  6. Содержание
  7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
- Акушерство и гинекология - Анатомия - Андрология - Биология - Болезни уха, горла и носа - Валеология - Ветеринария - Внутренние болезни - Военно-полевая медицина - Восстановительная медицина - Гастроэнтерология и гепатология - Гематология - Геронтология, гериатрия - Гигиена и санэпидконтроль - Дерматология - Диетология - Здравоохранение - Иммунология и аллергология - Интенсивная терапия, анестезиология и реанимация - Инфекционные заболевания - Информационные технологии в медицине - История медицины - Кардиология - Клинические методы диагностики - Кожные и венерические болезни - Комплементарная медицина - Лучевая диагностика, лучевая терапия - Маммология - Медицина катастроф - Медицинская паразитология - Медицинская этика - Медицинские приборы - Медицинское право - Наследственные болезни - Неврология и нейрохирургия - Нефрология - Онкология - Организация системы здравоохранения - Оториноларингология - Офтальмология - Патофизиология - Педиатрия - Приборы медицинского назначения - Психиатрия - Психология - Пульмонология - Стоматология - Судебная медицина - Токсикология - Травматология - Фармакология и фармацевтика - Физиология - Фтизиатрия - Хирургия - Эмбриология и гистология - Эпидемиология -