ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом исследования послужил головной мозг 216 экспериментальных животных ‑ беспородные белые крысы-самцы. В целом результаты работы базировались на изучении 1728 объектов (миндалевидное тело).

Выбор объекта экспериментального исследования обусловлен тем, что относительно короткий жизненный цикл крыс позволяет экспериментально исследовать действие изучаемых препаратов на особях разного возраста, что в случае с другими лабораторными животными было бы весьма затруднительно. В эксперименте были задействованы только самцы, с целью избежать некорректности в постановке эксперимента, обусловленной наличием у самок циклических гормональных влияний. Дополнительным фактором в пользу выбора крыс в качестве экспериментального объекта послужило и то, что крыса является одним из основных объектов исследования при изучении памяти, способности к обучению, пищевых, половых и других поведенческих реакций, в регуляции которых принимают участие исследуемые нами структуры. Небольшие линейные размеры исследуемого материала (головной мозг крыс) дали возможность исследовать ядра и основные части (отделы) миндалевидного тела (МТ) на фронтальных срезах всего головного мозга и тем самым определить топографические отношения исследуемых структур и окружающих их образований.

Экспериментальная часть исследования выполнена на 168 белых беспородных крысах самцах 2-х возрастных групп (неполовозрелые и репродуктивного возраста). В соответствии со схемой возрастной периодизации И.П. Западнюка и соавт. [67] отбирались животные неполовозрелые и периода полового созревания (самцы 1 и 5 месяцев от рождения): неполовозрелый возраст (m = 50-60 гр.) и молодой возраст репродуктивного периода (m = 180-200 гр.) Кроме того, исследовался материал от 48 контрольных (вводилась плацебо) животных.

Экспериментальной моделью служил процесс длительного внутрижелудочного введения животным водной суспензии барбитуратов (фенобарбитона и бензонала) с последующей коррекцией влияния последних силибором, который вводился также внутрижелудочно в виде водной суспензии.

Выбор использованных в работе барбитуратов не случаен: фенобарбитон – наиболее широко и длительно применяемый в клинической практике препарат этой группы лекарственных средств [25, 189]. Что касается бензонала, то в последнее время проводится изучение преимуществ и недостатков (по терапевтической эффективности и выраженности побочных действий) этого препарата в сравнении с фенобарбиталом [136, 152, 153, 168]. В качестве корректора предполагаемых морфологических изменений МТ головного мозга при хроническом использовании вышеуказанных барбитуратов был выбран отечественный препарат силибор, обладающий гепатопротекторным и детоксикационным действием. Обоснованием к применению данного препарата послужила его способность изменять метаболизм клеток при продолжительном действии барбитуратов, а также снижать количество щелочной фосфотазы, повышение уровня которой наблюдается при применении фенобарбитона [57].

В работе применяли фенобарбитон в таблетированной лекарственной форме производства: «Elegant India», бензонал казанского производственного химико-фармацевтического объединения «Татхимфармпрепараты» и силибор харьковской фармацевтической фирмы «Здоровье». Все медикаменты приобретены на Луганском областном коммунально-производственном предприятии «Фармация».

Животные обеих исследуемых возрастных групп были разделены на серии в зависимости от вида и дозы вводимого препарата. Так, в сериях «Ф1» и «Ф2» представлены животные, получавшие фенобарбитон в дозах 30 и 70 мг/кг соответственно [137, 150]. Среди неполовозрелых крыс выделена серия животных «Б», которым вводили 35 мг/кг бензонала [48, 49, 137]. Контролем «К» для этих серий служили животные, получавшие дистиллированную воду из расчета 10 мл/кг. Серию «С» составили животные, которые на фоне введения 30 мг/кг фенобарбитона получали силибор в дозе 80 мг/кг, как корректор [137].

Все препараты вводились ежедневно в одно и тоже время в виде суспензии на дистиллированной воде при помощи металлического желудочного зонда.

Постановка эксперимента осуществлялась в соответствии с Правилами проведения работ с экспериментальными животными [67]. Опыты проводились и с учетом «Правил доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP)» [129]. Эксперимент проводился в осенне-зимний период года. Все животные содержались в стандартных условиях вивария, находились на стандартном рационе, в одинаковых условиях содержания и питания. В ходе эксперимента проводились наблюдения за динамикой массы тела подопытных животных каждые 10 дней. При ежедневном наблюдении за общим состоянием и поведением животных отклонений не выявлено.

С целью изучения длительного влияния барбитуратов на морфологию МТ головного мозга крыс исследования нервной ткани проводились на 7, 15, 30 и 60 сутки после начала введения препаратов.

Таким образом, экспериментальные животные в работе распределялись по возрасту, сериям и срокам эксперимента (табл. 2.1).

Умерщвление животных производилось путем декапитации под эфирным наркозом с соблюдением основных требований к эвтаназии, изложенных в «Методических рекомендациях по выведению лабораторных животных из эксперимента» [99]. Для аккуратного и щадящего извлечения головного мозга мелких животных автором было предложено «Устройство для фиксации головы лабораторного животного (крысы) во время манипуляции

Таблица 2.1

Распределение экспериментальных животных по возрасту, сериям и срокам эксперимента

извлечения головного мозга» (удостоверение № 3441), а также разработан и освоен «Способ применения ножниц-зонда Шоттера для вскрытия костей мозгового отдела черепа лабораторного животного во время манипуляции извлечения головного мозга» (удостоверение № 3440).^[1] Вышеуказанное устройство представляло собой фиксирующие голову лабораторного животного (крысы) «тиски», напоминающие головодержатель для фиксации головы при стереотаксических операциях.

Сущность предложенного автором способа вскрытия костей мозгового черепа с помощью ножниц-зонда Шоттера заключалась в следующем. Как известно, ножницы-зонд Шоттера – это ножницы, имеющие на конце нижней бранши небольшой тупоконечный зонд и изогнутые в плоскости режущих граней. При проведении манипуляции извлечения головного мозга мелкого лабораторного животного (крысы) необходимо разрезать череп с кожей по направлению сагиттального синуса, а также провести еще два параллельных разреза, как можно ближе к ушным отверстиям. При проведении последних манипуляций бранша ножниц-зонда Шоттера, имеющая зонд, аккуратно вводилась по направлению синуса, а затем между мозговыми оболочками, тупо разъединяя оболочки мозга. Затем кости черепа легко удалялись пинцетом (рис. 2.2).

Исследуемый материал (головной мозг) фиксировали в 10 % нейтральном формалине на физиологическом растворе с последующей заливкой в парафин и парафин-целлоидин. Затем, в соответствии с рекомендациями Г.А. Меркулова [98], производилось приготовление серийных тотальных парафиновых срезов толщиной 5-10 мкм. В соответствии с рекомендациями Е.И. Таракановой и Л.Б. Калимуллиной [72, 164] срезы выполнялись во фронтальной плоскости, как наиболее целесообразные для исследования ядер и основных частей МТ. Срезы окрашивались крезиловым фиолетовым по Нисслю в модификации В.И.

Рис. 2.1. Фотография устройства для фиксации головы лабораторного животного (крысы) при извлечении головного мозга:

1 – кожаный ремень с «липучкой»;

2 – тракционная жердь;

3 – затылочный игольчатый винт;

4а, 4б – ушные винты;

5 – струбциноподобный держатель.

Рис. 2.2. Фотография ножниц-зонда Шоттера, применяемых для вскрытия костей мозгового отдела черепа лабораторного животного (крысы) при извлечении головного мозга:

1 – бранша с зондом;

2 – небольшой тупоконечный зонд;

3 – изгиб ножниц.

ультрамикротома УМТП-6 («SELMI», г. Сумы), контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца. Просмотр и фотографирование срезов производили в электронном микроскопе ПЭМ-125К («SELMI», г. Сумы) при ускоряющем напряжении 75 кВ.

Нами было проведено изучение влияния барбитуратов на структурные особенности и ядер, и основных частей или отделов (базо-латеральный и кортико-медиальный) МТ головного мозга крыс, так как ядра указанных отделов имеют практически аналогичный нейронно-глиальный состав и взаимосвязаны функционально [70, 105, 106, 183, 191, 192]. При этом в соответствии с поставленной целью и задачами исследования вначале была изучена топография и морфологические особенности МТ головного мозга крыс в норме (контроль), а затем после проведения эксперимента.

Окрашенные крезиловым фиолетовым по Нисслю и гематоксилин-эозином тотальные фронтальные срезы головного мозга крыс исследовались в светооптическом микроскопе и фотодокументировались с помощью цифрового фотоаппарата «Olympus C-160». Данные методы исследования позволили изучить структуру ядер основных отделов МТ головного мозга крыс в норме, а также характер, глубину и последовательность развития морфологических преобразований последних в ходе эксперимента.

При изучении морфофункциональных особенностей нейронов и глии ядер МТ головного мозга крыс в различные возрастные периоды после хронической интоксикации барбитуратами во избежание неверной трактовки результатов и с целью исключения ошибок во внимание приняты имеющиеся литературные данные [31, 63, 112, 127, 128, 141, 145, 179, 181, 183, 207].

При исследовании и анализе морфологических преобразований МТ головного мозга крыс использовались, а затем анализировались следующие морфометрические показатели:

- большой и малый диаметры тел нервных клеток и их ядер (А и В);

- площадь сечения нейронов (S_кл);

- площадь сечения ядер нейронов (S_яд);

- площадь цитоплазмы нейронов (S_кл – S_яд);

- ядерно-цитоплазматическое соотношение .

Площадь сечения нейронов и их ядер вычислялась в мкм² с помощью окулярного микрометра с подвижной шкалой МОВ-1-15х при увеличении объектива 40 по формуле:

(мкм²),

где:

А и В – большой и малый диаметры тела клетки и его ядра;

Е – цена деления окулярного микрометра;

П – число делений окулярного микрометра.

Затем на площади 1 мм² мозгового вещества с помощью измерительной сетки Г.Г. Автандилова [1] вычисляли вторичные морфометрические показатели:

- плотность нервных клеток (Н);

- плотность общей глии (Г);

- плотность сателлитной глии (С);

- глиальный индекс (Г/Н) – отношение плотности общей глии к плотности нейронов;

- интерглиальный коэффициент (С/Г) – отношение плотности сателлитной глии к плотности общей глии;

- перинейрональный индекс (С/Н) – отношение плотности сателлитной глии к плотности нервных клеток.

При этом, при анализе плотности клеток (нейроны и макроглия) ядер МТ, для большей наглядности, на ряду с другими методами, нами предложен цвето-графический метод анализа плотности клеток, где различные оттенки цвета соответствуют различной плотности клеток отдельных ядер 2-х частей МТ (от наименьшей плотности к наибольшей, соответственно в цветовой гамме – от наименьшей интенсивности цвета к наибольшей). Данная модель позволяет наглядно проследить и сравнить изменения плотности клеток в ходе эксперимента в различных ядрах и частях МТ на тотальных фронтальных срезах и в передне-заднем направлении изучаемой структуры мозга [72]. Нами были разработаны цветовые гаммы для обозначения плотности нейронов (синий цвет), плотности общей глии (красный цвет) и сателлитной глии (зеленый цвет) (рис. 2.3).

Рис. 2.3. Распределение оттенков цветовой гаммы в соответствии с плотностью клеток МТ головного мозга крыс (на 1 мм² мозгового вещества).

Для получения сравнимых и достоверных результатов использовался только одинаково обработанный материал, так как известно, что разные гистологические методы обработки (фиксация, заливка, методы резки, окраска) вызывают различную ядерно-цитоплазматическую ретракцию на 10-70 % [165].

Все полученные в работе цифровые данные сведены в таблицы и матрицы. При этом для обработки количественных данных, полученных в результате морфометрии, использовались методы вариационной статистики, а также корреляционный и однофакторный дисперсионный анализы [85, 87, 125].

Так, с помощью вариационной статистики вычислялись средние выборочные (М) по каждому из 9 показателей, характеризующих состояние ядер МТ головного мозга крыс, а также ошибка средней выборочной (m). Цифровые данные, полученные в результате эксперимента, достоверны с вероятностью ошибки менее 5 % (p < 0,05). Это позволило установить, что распределение числовых данных, полученных в контрольных и экспериментальных группах, подчиняются закону нормального распределения, что позволило использовать критерий Стьюдента-Фишера для определения достоверности различия указанных количественных характеристик ядер МТ как в контрольной, так и экспериментальной группах животных.

Корреляционный анализ был необходим для установления взаимосвязей между ядрами базо-латерального и кортико-медиального отделов МТ головного мозга в контрольной группе крыс и для определения характера изменений во взаимосвязях названных отделов, которые произошли в результате проведенного эксперимента.

Однофакторный дисперсионный анализ применялся для того, чтобы выяснить какой вид и какая доза барбитуратов, время воздействия последних с корректором и без, оказывает наиболее сильное влияние на морфологию ядер различных отделов МТ головного мозга крыс с учетом их возраста, а также какой из изучаемых отделов МТ являлся наиболее уязвимым в результате эксперимента.

В результате, полученный в эксперименте цифровой материал, был систематизирован и обработан в виде матриц. Все расчеты производились с помощью приложений Microsoft Office 2000 на персональном компьютере Duron 760.

В работе использована терминология последних Международных анатомической и гистологической номенклатур [9, 100].