Методы исследования

2.2.1. Методы морфолого-анатомического исследования

Метод микроскопических исследований

Микроскопический анализ проводили на образцах полыни эстрагон, аналогичных тем, которые использовались для изучения химического

состава.

Для приготовления микропрепарата листа полыни эстрагон применялся горячий способ размягчения, как наиболее простой и быстрый вариант [38]. Недостаток этого метода - сильное разбухание оболочек и вымывание содержимого клеток - мы устранили посредством модифицированного нами способа: кипячение листьев в 0,5 % растворе щелочи (по стандартной методике концентрация щелочи составляет 3-5 %) с последующим промыванием проточной водой. В качестве просветляющей жидкости использовали глицерин. Анатомические исследования продольного среза листовой пластинки осуществляли с использованием микроскопа “Биолам” с увеличениями К 15x8; К 15x20; К 15x40; МБР-1 с увеличением х 280; МБС-9 с увеличениями 8x0,6; 8x1; 8x2; 8x4; 8x7; МБИ-6 с увеличениями х 200; х 90; х 35 [37,38, 64].

Гистохимический анализ растительного сырья

■ Для обнаружения эфирного масла в тканях листа растения использовали реакцию с Суданом III [38, 81]. Наблюдается окрашивание содержимого эфиромасличных железок в оранжевый цвет [38].

■ Для обнаружения флавоноидов была использована общеизвестная реакция с раствором алюминия хлорида. Наблюдается образование желтого окрашивания [79].

Химические реакции

Качественные реакции:

1. Флавоноиды.

I. Присутствие флавоноидов в водно-спиртовом извлечении травы полыни эстрагон устанавливали специфической цианидиновой реакцией [219]: к 1-2 мг исследуемого вещества, растворенного в 1 мл спирта, прибавляют 5 капель концентрированной кислоты хлористоводородной и 5-10 мг магния. Образуется красно-малиновое окрашивание [70].

II. Существует модификация цианидиновой реакции - цианидиновая реакция по Брианту [70, 184]: раствор, полученный по реакции I, разбавляют водой и обрабатывают октиловым спиртом.

Ш. Реакциея с 2 % раствором алюминия хлорида. Присутствие флавоноидов в водно-спиртовом извлечении травы полыни эстрагон обнаруживается по появлению желто-зеленой окраски [30, 31, 32, 70].

IV. Проба Гиббса [193].

К спиртовому раствору флавоноида приливают 2-3 капли раствора реактива Гиббса (хлоримид 2,6-дибром-бензохинона) и 1 мл боратного буфера (pH 9,4). Глубокая синяя окраска характерна для фенолов с незамещенным «-положением (например, для 5-оксифлавонов, не имеющих заместителей при С-8).

2. Кумарины.

Присутствие кумаринов в водно-спиртовом извлечении травы полыни эстрагон устанавливали с использованием характерной реакции - лактонной пробы [30,31,32, 70,158].

К 3-5 мл спиртового извлечения добавляют 10 капель 10 %-ного КОН в метиловом спирте и полученный раствор нагревают на водяной бане. При этом появляется окраска желто-оранжевого цвета. Затем к

реакционной смеси добавляют 5-10 мл очищенная воды и перемешивают, после чего раствор нейтрализуют 10 %-ной НС1 до кислой реакции. Если при этом наблюдается помутнение или выпадение осадка, то это указывает на вероятное присутствие кумаринов в сырье [158].

3. Дубильные вещества.

Для обнаружения дубильных веществ и флавоноидов в лекарственном растительном сырье растения использовали реакцию 3 %- ным водным раствором железа хлорида (Ш). Ткани, содержащие дубильные вещества и флавоноиды, окрашиваются от соли железа в черно­зеленый цвет [38].

4. Алкалоиды.

Для обнаружения алкалоидов в тканях листа растения использовали реакции осаждения [158].

Для проведения качественных реакций из растительного сырья тархуна готовили кислотное извлечение. Алкалоиды из растительного сырья полыни эстрагон извлекали 1-5%-ным раствором минеральной кислоты (кислота хлористоводородная, кислота серная). Данную качественную реакцию рекомендуют проводить на предметном стекле. На предметное стекло аккуратно помещают 1 каплю кислотного извлечения алкалоидов из лекарственного сырья и рядом с ней 1 каплю соответствующего реактива.

В целях повышения доказательности опыта проводились реакции с несколькими различными растворителями [ 12, 30, 31, 32].

1) реактив Драгендорфа (раствор нитрата висмута основного и калия йодида с добавлением кислоты уксусной);

2) раствор танина;

3) реактив Майера (раствор ртути дихлорида и калия йодида);

4) 1 % раствор кислоты кремневольфрамовой.

5. Сапонины.

1) Реакция на стероидные сапонины:

а) Реакция пенообразования.

Берут две пробирки, в одну из них приливают 5 мл 0,1 н. НС1, а в другую - 5 мл 0,1 н. NaOH. Затем в обе пробирки добавляют по 2-3 капли извлечения или раствора сапонинов и сильно встряхивают. Если сырье содержит сапонины стероидной группы, то в щелочной среде образуется пена в несколько раз больше по объему и стойкости по сравнению с пеной в кислой среде [121].

б) Реакция Либермана-Бурхардта.

К 1-2 мг вещества добавляют 1 мл смеси кислоты серной концентрированной и уксусного ангидрида (50:1). Красно-фиолетовая окраска свидетельствует о стериновой или стероидной природе вещества [121].

2) Реакция на тритерпеновые сапонины:

а) Реакция пенообразования.

Берут две пробирки, в одну приливают 5 мл 0,1 н. НС1, а в другую - 5 мл 0,1 н. NaOH. Затем в обе пробирки добавляют по 2-3 капли извлечения или раствора сапонинов и сильно встряхивают. При наличии в сырье тритерпеновых сапонинов в обеих пробирках образуется пена, равная между собой по объему и стойкости [121].

б) Реакция Лафона.

К 2 мл водного настоя прибавляют 1 мл концентрированной серной кислоты, 1 мл этилового спирта и 1 каплю 10 %-ного раствора железа сернокислого. При нагревании появляется сине-зеленое окрашивание. Данный эффект реакции указывает на содержание тритерпеновых сапонинов в лекарственном растительном сырье [121].

2.2.2. Технологические методы

Для получения настоя полыни эстрагон нами применялась общепринятая фармакопейная методика [32].

Для получения настойки полыни эстрагон с максимальным выходом биологически активных веществ были использованы следующие методы экстрагирования: метод мацерации, метод перколяции, метод [32, 121, 103], а также методом модифицированной реперколяции.

Получение эфирного масла полыни эстрагон осуществлялось по фармакопейной методике №1 (метод Гинзберга) [31,121].

2.2.3. Метод ТСХ-анализа

Методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) проводилось изучение образцов эстрагон Artemisia dracunculus L., а также осуществлялся контроль чистоты выделенных веществ с использованием метода колоночной хроматографии [23, 31, 55, 56, 57, 64, 120, 152, 153, 174, 175]. В данном методе были использованы пластинки “Силуфол УФ-254”, а также ’’Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ”, ’’Сорбфил ПТСХ-А-А-УФ”. Хроматографические пластинки предварительно выдерживали в сушильном шкафу при температуре 100-105 °С в течение 1 часа с целью их активирования. Для хроматографического анализа были использованы следующие хроматографические системы растворителей:

1) хлороформ - метанол - вода (26:14:3) - система А;

2) хлороформ - этиловый спирт 9:1- система В;

3) хлороформ - этиловый спирт 6:1- система С;

4) хлороформ - этиловый спирт 4:1 - система D;

5) хлороформ - этиловый спирт 3:1 - система Е;

6) хлороформ - этиловый спирт 2:1- система F;

7) хлороформ - этиловый спирт 19:1- система G;

Для достижения чёткого разделения веществ перед помещением хроматограммы в камеру с приготовленной системой, последнюю насыщали парами растворителей в течение 24 часов. Анализ проводился при комнатной температуре, когда фронт прохождения растворителя составлял 13 см [31, 87].

После хроматографирования пластинки высушивали на воздухе, просматривали в видимом и УФ-свете при длине волны Х,=254 нм и Х=366 нм. Далее пластинку обрабатывали раствором диазобензолсульфокислоты (ДСК) с помощью пульверизатора [30, 31].

Приготовление раствора диазобензолсульфокислоты:

8,65г сульфаниловой кислоты растворяют при слабом нагревании в 50 мл 1 н. раствора едкого натра, охлаждают до комнатной температуры и прибавляют 40 мл раствора нитрита натрия. При помешивании прибавляют 40 мл разведенной серной кислоты. Выделившиеся кристаллы отсасывают на воронке Бюхнера или на стеклянном фильтре, промывают 3 раза по 5 мл ледяной воды и высушивают при комнатной температуре [30].

Полученный бесцветный мелкокристаллический порошок - диазобензолсульфокислота - стабилен при хранении и позволяет оперативно получать раствор для проявления ex tempore. Применение же альтернативного варианта - диазореактива (также на основе сульфаниловой кислоты) [30, 31] усложняет решение задачи, так как его

получение неоправданно продолжительно во времени и каждый раз предусматривает проведения трудоемкой методики.

2.2.4. Метод колоночной хроматографии

Для изучения химического состава травы полыни эстрагон и для препаративного выделения веществ в индивидуальном виде нами использовался метод адсорбционной колоночной хроматографии [31, 55, 120].

В качестве сорбентов нами были использованы:

1) Силикагель L 40/100 (Чехия);

2) Полиамид, полученный по методике В.И. Литвиненко, Н.П. Максютиной и Д.Г. Колесникова [84] или полиамид марки “Woelm” (Германия);

3) Сефадекс LH -20 (Швеция).

В процессе эксперимента проводили элюирование гексаном, смесью гексан - хлороформ в различных соотношениях, а затем хлороформом и смесью хлороформ - этанол в различных соотношениях. Эффективного разделения и очистки веществ добивались путем чередования сорбентов и соответствующих систем растворителей [42, 43].

2.2.5. Метод спектрофотометрии

Спектрофотометрическое исследование проводилось нами для качественной и количественной оценки содержания суммы флавоноидов в траве полыни эстрагон [5, 9, 137, 154]. Для этих целей использовался метод прямой и дифференциальной спектрофотометрии на спектрофотометре СФ-26 или СФ-46 в кюветах толщиной слоя 10 мм. В качестве растворов сравнения были взяты 40 % этиловый спирт и раствор Б [31, 55, 152, 153].

2.2.6. Метод ВЭЖХ

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) был исследован образец настойки полыни эстрагон [26, 31, 103, 109, 116, 228].

Исследование проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе "Милихром-1" (стальная колонка 120x2 мм; сорбент - Сепарон Cig) в обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы использовали смесь “ацетонитрил-вода” (50:50 об.%). Скорость подачи элюента составила 200 мкл/мин. Детектирование веществ осуществляли УФ-детектором при длине волны Х=290 нм. В качестве несорбирующегося вещества нами использован нитрит натрия. Качественный анализ мы проводили посредством регистрации времен удерживания веществ. Количественный анализ осуществляли методом внутреннего стандарта с использованием вещества-стандарта ГСО пиностробина [4].

2.2.7. Метод ГЖХ

Методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) было исследовано эфирное масло полыни эстрагон [31, 52, 58, 85,117,135, 157, 163].

Исследование проводили на хроматографе "Цвет-100” с пламенно­ионизационным детектором (металлическая колонка (200см х 2 см). В качестве неподвижной фазы использовался силикон SE-30. Твердым носителем являлся Chromaton N-AW. В качестве газа-носителя использовали азот. Кондиционирование колонки проводили путем продувания колонки азотом при температуре 200 ⁰ С. Скорость газа- носителя составляла 30 мл/мин. Анализируемые пробы растворялись в смеси этанола и четыреххлористого углерода (1:1) и вводились в хроматограф микрошприцом емкостью 10 мкл. Регистрация времен удерживания пиков веществ проводилась с помощью секундомера

двухстрелочного. Компоненты эфирного масла полыни эстрагон изучались путем моделирования условий хроматографирования с целью максимально четкого разделения пиков веществ, а также регистрации времен удерживания соответствующих компонентов. В качестве “пристрелочных” образцов были использованы: масло фенхеля, индивидуальные вещества - лимонен, эвгенол, тимол.

2.2.8. Методы установления структуры выделенных веществ

Химическое строение выделенных веществ изучали с помощью

ЯМР-спектроскопии, УФ-спектроскопии [207, 220, 221], масс-

спектрометрии, различных химических превращений (кислотный гидролиз, ферментативный гидролиз) [19, 31, 70, 55, 58, 103, 113, 114, 135].

Кислотный гидролиз.

1. 10 мг гликозида (1) нагревали с 3 мл 2 % НС1 на кипящей водяной бане в течение 5-30 мин. При этом полноту гидролиза проверяли методом ТСХ. Из охлажденной смеси отфильтровывали кристаллы агликона через взвешенный стеклянный фильтр, а в случае некристаллического агликона его извлекали из кислотного гидролизата хлороформом. Водный раствор упаривали в вакууме и использовали для идентификации углевода методом БХ.

2. Гидролиз 7-О-глюкозида пиноцембрина проводили в более жестких условиях: 10 мг гликозида растворяют в 3 мл спирта или смеси спирт- хлороформ (1:1), добавляют 5 мл 10 % НС1 и нагревают в течение 2-3 часов при 100 ⁰ С. Из охлажденной смеси отделяют кристаллы агликона и затем для идентификации сахара гидролизат нейтрализуют на анионите (ДАУЭКС-1 в НСОз " форме) и упаривают.

Ферментативный гидролиз.

5 мг гликозида термостатировали в течение 24 часов в ацетатном буфере (pH 5,4) с 1 мг р-глюкозидазы при температуре 38 °С. Из гидролизата агликон извлекали хлороформом и анализировали его методом ТСХ, масс-спектрометрии и другими методами, а в водном растворе методом БХ идентифицировали углевод.

Ацетилирование.

Смесь 10 мг соединения, 0,5 мл безводного пиридина, 1 мл свежеперегнанного уксусного ангидрида оставляют на 24 часа при 20 °С. Полноту ацетилирования контролировали методом ТСХ (при облучении УФ-светом пятна ацетатов веществ на пластинках имеют ярко-голубую флуоресценцию). При добавлении ледяной воды из реакционной смеси выпал осадок, который промывали 4 раза водой и многократно перекристаллизовывали из спирта. В случае некристаллических ацетатов (извлекают из реакционной смеси хлороформом) или некристаллизующихся из спиртов ацетатов, их очищали колоночной хроматографией на силикагеле в системе гексан-хлороформ (9:1, 6:1 или 4:1).

2.2.9. Методы микробиологического исследования

Микробиологические исследования травы и препаратов полыни эстрагон проведено нами под руководством доцента И.П. Жданова на кафедре микробиологии СамГМУ.

Антибактериальная активность травы тархуна проверяли на следующих лекарственных формах, полученных из надземной части растения: настой, настойки полыни эстрагон на 40, 70 и 96 % этиловом спирте. Антимикробные свойства препаратов исследовали методом бумажных дисков и методом серийных разведений в отношении наиболее встречаемых грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов

(золотистый стафилококк, картофельная палочка, кишечная палочка, дизентерийная палочка, сальмонелла Гертнера, синегнойная палочка [32, 35, 60,106].

В качестве контроля использовали 40, 70 и 96 % этиловый спирт в том же количестве, а также некоторые растительные (настойка эвкалипта, настойка чистотела, сангвиритрин) и синтетические антимикробные лекарственные средства (раствор перманганата калия 5 %, раствор фурацилина 0,02 %, димексид, хлоргексидин).

Максимально испытуемая концентрация в экспериментах составила 100 мг/мл и 20000 мкг/мл.

Изучение методом бумажных дисков.

Для качественной оценки препаратов их изучение проводили методом бумажных дисков.

На поверхность плотной питательной среды методом газона засевалась эталонная культура золотистого стафилококка штамма Р - 109, а затем на равном расстоянии размещались диски фильтровальной бумаги. На диски микропипеткой наносились препараты полыни эстрагон по 0,01 мл. В качестве контроля на диски наносили 40, 70 и 96 % этиловый спирт в том же количестве, а также некоторые растительные (настойка эвкалипта, настойка чистотела, сангвиритрин) и синтетические антимикробные лекарственные средства (раствор перманганата калия 5 %, раствор фурацилина 0,02 %, димексид, хлоргексидин).

Посевы помещались на сутки в термостат (t = 37 ⁰ С), после чего учитывались результаты: измерялся диаметр зоны задержки роста микроба.

Изучение методом серийных разведений.

Для количественной характеристики антимикробной активности препаратов (настой, 40, 70 и 96 % настойки полыни эстрагон) во флакон с 20 мл расплавленной и остуженной до 56 °С питательной среды вносились

препараты тархуна до концентрации 100; 50; 12,5 и 6,25 мг/мл, перемешивались и заливались в стерильные чашки Петри.

В качестве контроля использовали 40, 70 и 96 % этиловый спирт. После застывания среды чашки засевались музейными тест -

штаммами микроорганизмов, а через сутки инкубирования в термостате учитывались результаты опытов.

Изучение противогрибковой активности

Для титрования фунгистатических доз препаратов тархуна использовались такие виды дерматофитов (по два штамма), как трихофитон красный и микроспорон канис, а также такой вид грибов рода Candida, как Candida albicans и актиномицеты.

Для этого делались разведения препаратов, кратные двум с помощью расплавленной и остуженной среды Сабуро. Разведенные таким образом препараты заливались в чашки Петри и оставлялись до застывания, после чего по секторам засевалась взвесь грибов. Посевы инкубировались в термостате при t=29 °С.

Результаты в отношении грибов рода Candida учитывалась через двое суток, а в отношении дерматофитов - через 5 суток. Максимально испытуемая концентрация препаратов составила 1000 мкг/мл.

Статистическую обработку полученных данных проводили по методике ГФ XI и t -критерию достоверности Стьюдента с помощью пакета анализа Excel (Microsoft Office ХР) [11,31, 32].