<<
>>

2.2.2. Молекулярно – генетические методы анализа полиморфизма генов

Всего было изучено 9 полиморфных вариантов пяти генов – кандидатов подверженности туберкулезу. Исследовали 4 полиморфных варианта гена NRAMP1: 469+14G/C (INT4) – трансверсия гуанина на цитозин в 4 интроне, С274Т – консервативная замена в 3 экзоне, 1465-85 G/A – транзиция в 13 интроне и D543N – неконсервативная замена цитозина на аденин в 15 экзоне; два полиморфизма VDR гена: B/b, F/f; полиморфный вариант IL1B гена в 5 экзоне +3953А1/А2; VNTR полиморфизм гена IL1RN, расположенный во 2 интроне.

Также выборки генотипировали по полиморфизму гена IL12В, обусловленному трансверсией аденина на цитозин в 3`-UTR области (табл. 4) .

Для генотипирования индивидов по указанным полиморфизмам использовали образцы тотальной ДНК, выделенной из цельной венозной крови по стандартной неэнзиматической методике [Маниатис Т. и др., 1984; Lahiri D. et al., 1992]. Выделенную ДНК замораживали и хранили при температуре -20° С до проведения эксперимента. Генотипирование осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл.5).

Смесь для ПЦР содержала 0,5-2,0 мкл специфической пары праймеров с концентрацией 1 о.е./мл, 1,2-1,8 мкл 10´ буфера для амплификации с концентрацией MgCl2 0,5-2,0 mM, 0,5-1,0 е. а. Taq ДНК-полимеразы («Сибэнзим», «Медиген», Новосибирск) и 100-200 нг геномной ДНК. Смесь помещали в 0,5 мл пробирки типа «Эппендорф», наслаивали сверху минеральное масло для предотвращения испарения и амплифицировали в автоматических минициклерах «MJ Rеsearch» (США) и «БИС 108» (Россия-Новосибирск).

Программа амплификации включала предварительную денатурацию при 94°С в течении 5 минут, с последующими 30-35 циклами отжига при температуре 60°С (1мин.), элонгации цепи при 72°С (40 сек.) и денатурации при 94°С (40 сек.). Программу завершала финальная элонгация при 72°С в течение 3 минут.

Амплификат подвергали гидролизу соответствующей рестриктазой (табл.5) при оптимальной для фермента температуре в течении 12-24 ч. Рестрикционная смесь включала 5-7 мкл амплификата, 1,0-1,2 мкл 10´ буфера для рестрикции, поставляемого фирмой – производителем («Сибэнзим», Новосибирск), и 1-5 единиц активности фермента (в зависимости от эффективности его работы). Продукты рестрикции фракционировали в 3% агарозном геле при напряжении 120 В в течении 30 минут. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали в ультрафиолетовом свете.

Таблица 4

Структура материала популяционных выборок г. Томска и Томской области, изученных по полиморфным ДНК-маркерам генов

NRAMP1, VDR, IL1B, IL12B, IL1RN

Ген Полиморфизм Выборка больных туберкулезом Выборка здоровых индивидов
NRAMP1 469+14G/C 279 137
D543N 278 139
1465-85G/A 279 135
274C/T 299 116
IL12B 1188А/С 279 129
VDR B/b 293 108
F/f 298 113
IL1B +3953A1/A2 301 139
IL1RN VNTR 299 140

Таблица 5 Характеристики исследованных полиморфизмов

Ген Полимор-физм Структура праймеров

отжига прай-меров, оС

Фермент рестрик-ции Продукты гидролиза,

п. н.

Литерату-ра
Аллель «дикого» типа Мутантный аллель
1 2 3 4 5 6 7 8
NRAMP1 274C/T 5’-tgccaccatccctatacccag –3’

5’-tctcgaaagtgtcccactcag –3’

60 Mnl I 167;37;12 bp 102;65;37;

12 bp

Liu J.
et al., 1995
469+14

G/C

5’-tctctggctgaaggctctcc –3’

5’-tgtgctatcagttgagcctc – 3’

60 Apa I 624 bp 455;169 bp
1465-85G/A 5’-gcaagttgaggagccaagac –3’

5’-acctgcatcaactcctcttc –3’

60 Bsе 1I 142;75;24

bp

102;75;40;

24 bp

D543N 5’-gcatctccccaattcatggt –3’

5’-aactgtcccactctatcctg –3’

60 Bme 18I 126;79;39 bp 201;39 bp
IL12 A1188C 5’-ttctatctgatttgcttta –3’

5’-tgaaacattccatacatcc –3’

43 Taq I 233 bp 165;68 bp Hall M. A. еt al., 2000

Продолжение таблицы 5

1 2 3 4 5 6 7 8
VDR B/b 5’-aacttgcatgaggaggagcatgtc-3’

5’-ggagaggagcctctgtcccatttg-3’

60 Pct I 813 bp 505;308 bp Wilkinson R.J. et al., 2000
F/f 5’-agctggccctggcactgactctgctct-3’

5’-atggaaacaccttgcttcttctccctc-3’

60 Fok I 267 bp 197;70 bp
IL1B +3953

A1/A2

5’-gttgtcatcagactttgacc-3’

5’-ttcagttcatatggaccaga-3’

58 Taq I 220 bp 148; 72 bp Wilkinson R.J. et al., 1999
IL1RN VNTR 5’-tcctggtctgcaggtaa-3’

5’-ctcagcaacactcctat-3’

60 А1-410 п.о. (4 повтора)

А2-240 п.о. (2 повтора)

А3-500 п.о. (5 повторов)

А4-325 п.о. (3 повтора)

А5-595 п.о. (6 повторов)

Tarlow J.K. et al., 1993

<< | >>
Источник: КОЛОКОЛОВА О.В.. АЛЛЕЛЬНЫЕ ВАРИАНТЫ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ ПОДВЕРЖЕННОСТИ ТУБЕРКУЛЕЗУ У РУССКОГО НАСЕЛЕНИЯ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ. 2005

Еще по теме 2.2.2. Молекулярно – генетические методы анализа полиморфизма генов:

  1. 3.8 Молекулярно-генетические особенности возбудителей инвазивного кандидоза
  2. Молекулярно-генетические методы исследования
  3. 23. Игровые модели как метод анализа политических явлений.
  4. 4.1. Унификация и стандартизация методов анализа
  5. ОГЛАВЛЕНИЕ
  6. 2.2.2. Молекулярно – генетические методы анализа полиморфизма генов
  7. 50 2.2.3. Генетико – статистические методы анализа
  8. 3.2. Анализ связи полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN с туберкулезом
  9. Молекулярно-генетические особенности РМЖ в молодом и пожилом возрасте.
  10. АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ РЕПАРАЦИИ ДНК XRCC1 G280A XRCC1 С194Т, XRCC1 G399A и XPD А751С У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА
  11. Молекулярно-генетическое изучение болезни Паркинсона в Республике Башкортостан
- Акушерство и гинекология - Анатомия - Андрология - Биология - Болезни уха, горла и носа - Валеология - Ветеринария - Внутренние болезни - Военно-полевая медицина - Восстановительная медицина - Гастроэнтерология и гепатология - Гематология - Геронтология, гериатрия - Гигиена и санэпидконтроль - Дерматология - Диетология - Здравоохранение - Иммунология и аллергология - Интенсивная терапия, анестезиология и реанимация - Инфекционные заболевания - Информационные технологии в медицине - История медицины - Кардиология - Клинические методы диагностики - Кожные и венерические болезни - Комплементарная медицина - Лучевая диагностика, лучевая терапия - Маммология - Медицина катастроф - Медицинская паразитология - Медицинская этика - Медицинские приборы - Медицинское право - Наследственные болезни - Неврология и нейрохирургия - Нефрология - Онкология - Организация системы здравоохранения - Оториноларингология - Офтальмология - Патофизиология - Педиатрия - Приборы медицинского назначения - Психиатрия - Психология - Пульмонология - Стоматология - Судебная медицина - Токсикология - Травматология - Фармакология и фармацевтика - Физиология - Фтизиатрия - Хирургия - Эмбриология и гистология - Эпидемиология -