2.3.8. Гипероксия внутри опухолевой клетки

создаёт благоприятные условия для работы пероксисомальной окислительной системы – одной из форм дыхания, поскольку уровень этого дыхания в отличие от митохондриального пропорционален напряжению О2 в клетке (Панченко и др., 1981).

Участие пероксисом в перекисном обмене, их перекисная агрессивность применительно к процессу трансформации клеток – составная часть кисло-родно-перекисного механизма канцерогенеза. С этих позиций интересны следующие давние факты. Немутагенные химические канцерогены из группы пролифераторов пероксисом наряду с другими изменениями увеличивают интенсивность пероксисомального β-окисления жирных кислот, приводят к перекисному повреждению ДНК и инициации опухолевого роста, генерируя внутриклеточное образование Н2О2, индуцируют (до 100 %) гепатоцеллюлярные карциномы у крыс и мышей (Reddy et al., 1983). Сведения об индуци-ровании гиполипидемическими веществами пролиферации пероксисом печени грызунов и гепатоканцерогенеза опубликовывались этими авторами и в последующие годы, причём в одной из их работ показано, что антиоксиданты этоксихин и 2(3)-терт-бутил-4-оксианизол проявляли заметное антиканцерогенезное действие, и это объясняют способностью указанных антиоксидантов связывать Н2О2 и свободные радикалы. В обзоре (Rao, Reddy, 1987) высказано предпо-ложение, что пролифераторы пероксисом, не являясь мутагенами, действуют опосредованно путём взаимодействия с рецепторами мембран.

В аспекте сказанного небезынтересны результаты сравнения активности пероксисомального β-окисления жирных кислот в различных тканях крыс, содержавшихся на нормальной диете (группа 1) или в течение 2 нед. на диете с 0,025 % пероксисомального пролифератора ципрофибрата (группа 2). Показано, что уровень мРНК каталазы в группе 2 возрастал в 2 раза в печени, почках, тон-кой кишке и сердце по сравнению с группой 1. Уровни транскриптов трёх генов системы β-окисления жирных кислот в печени крыс 2-й группы были увеличены более 20 раз, а в почках, тонкой кишке и сердце – в 2-4 раза. Эти факты говорят о том, что ципрофибрат повышает активность пероксисомального окис-ления в различных тканях, но в основном это гепатотропный агент. Как полагают авторы данного исследования (Nemali et al., 1988), непрерывная длительная индукция пролифераторами пероксисом системы пероксисомального окисления, вызывающая окислительный стресс, является основой канцерогенеза.

Пероксисомальные пролифераторы объявляются, по существу, новым классом негенотоксических канцерогенных агентов, индуцирующих окислительный стресс и, главным образом, гепатоканцерогенез путём подавления актив-ности GPX, повышения уровня Н2О2 и радикалов НО˙, усиления ПОЛ и окис-лительного повреждения ДНК (Reddy, Rao, 1989; Yelgani et al., 2000). Кроме того, в указанных условиях в печени аккумулируется первичный продукт ПОЛ липофусцин, известный как возрастной пигмент, маркёр старения клеток и тканей (см. п. 1.2.2). Этот факт не является проявлением случайности, а отра-жает общность первичных звеньев кислородно-перекисного механизма старения и канцерогенеза.

Сходная точка зрения высказана и в других работах. Так, индуцированную пролифераторами пероксисом повышенную и продолжительную пролиферацию клеток и окислительный стресс в результате метаболизма пероксисомного О2 считают «критическим событием» канцерогенеза (Rose et al., 1999).

Пока же большинством исследователей признаётся лишь то, что 1) механизм канцерогенности, индуцируемой пролифераторами пероксисом, является нетипичным по сравнению с другими канцерогенами печени; 2) пролифераторы пероксисом скорее участвуют в изменениях экспрессии соответствующих генов-мишеней, чем в непосредственном мутагенезе (Anderson S. P. et al., 1999). Кстати, в качестве негенотоксических (эпигенетических) канцерогенов рассма-риваются также пестициды, индуцирующие пролиферацию клеток, вызывающие рак печени и другие негативные изменения. Все эти эффекты не являются результатом прямых взаимодействий пестицидов с ДНК. Как полагают (Rakitsky et al., 2000), они «действуют как промоторы, индукторы реакционно-активных кислородных радикалов, пролифераторы пероксисом и индукторы цитохром Р-450-зависимых ферментов».

В «пероксисомальном» вопросе неясными остаются механизмы пролиферации пероксисом, индуцируемой различными по химической структуре лекарствами и канцерогенами. Эти аспекты обсуждались в ряде работ. Пероксисомы, как и митохондрии и некоторые другие внутриклеточные органеллы, связаны с микротрубочками, исполняющими роль транспортных путей, причём этому способствуют ATP, моторные белки кинезин и динеин (Thiemann et al., 2000). Данная информация наводит на мысль, которую мы неоднократно высказывали в отношении митохондрий (см., например, п.

Участие пролифераторов пероксисом в гепатоканцерогенезе можно обсуж-дать и с позиций индукции ими некоторых изоформ CYP, при функционирова-нии которых образуются АФК, рассматриваемые как промоторы канцерогенеза (см. Кобляков, 1998). Указанные пролифераторы пероксисом индуцируют, в частности, CYP4А1 и CYP4А3 (Кржечковская и др., 2002). Действительно, в микросомах из печени животных, обработанных пролифераторами пероксисом, под влиянием образующихся АФК усиливается ПОЛ (Swierczynski et al., 1996). Однако, чтобы возникающая таким путём локальная «микросомальная» пероксигенация инициировала канцерогенез, она, по нашему мнению, должна перерасти в глобальный окислительный стресс, затронув прежде всего митохондрии. В этой связи понятен тот факт, что увеличение концентрации 8-OH-dG в ДНК (признака её окислительной модификации) печени крыс, подвергну-тых воздействию пролифераторов пероксисом, взаимосвязано с изменениями митохондрий (Sausen et al., 1995).

Итак, активация пероксисомального окисления и зарождающийся окисли-тельный стресс отражаются, несомненно, на многих внутриклеточных процес-сах, но по изложенным выше причинам (см.

Объектом липидной пероксидации может быть также однослойная липопротеидная мембрана лизосом. Её повреждением объясняются, по-видимому, некоторые факты повышения в опухолевых клетках активности лизосомных ферментов. Такие данные представлены, например, в отношении опухоли лёгкого Льюис. Специальной проверкой ранее было установлено, что этот феномен не связан с некрозом: в зонах, где его нет, активность гидролитических ферментов выше, чем в некротических участках (Dobrossy et al., 1980). Полезная в норме регуляторная роль протеолитических ферментов может привести и к патологическим изменениям в случае существенного повышения уровня и активности этих ферментов, вызванные дестабилизацией мембран лизосом. Не исключено, в частности, что разрушающее действие лизосомных ферментов касается и элементов цитоскелета. Как отмечалось в п. 2.3.4, нарушение цитоскелета вызывает уменьшение содержания фибронектина на клеточной повер-хности, снижение адгезивности и контактного торможения. Если эти и некоторые иные изменения, логично увязываемые с процессами инвазии и метастазирования, хотя бы отчасти обусловлены действием лизосомных протеаз в клетке и на её поверхности, значит уже в этом постулируемые нами внутриклеточные гипероксия и пероксидация причастны к возникновению указанных специфических свойств злокачественных опухолей. Несколько шире с привлечением и других причинных факторов вопрос об инвазивном росте и метастазировании неоплазм рассмотрен в отдельном подразделе 2.4.

2.3.9. В гипероксических и пероксигеназных условиях определённые изменения происходят и в мембранах ядерной оболочки, где выявлены богатый и своеобразный ферментативный профиль и, в частности, ферменты дыхательной цепи и ATP-аза.

Определённую роль в проявлении сдвигов в ферментных системах ядерной оболочки играет и АФК-продуцирующая способность электронотранспортных цепей мембран ядер (Збарский, 1982; Greenly, Davies, 1994; Пескин, 1997), кото-рая при избыточных рО2 и ПОЛ может усугублять состояние патологичности соответствующих клеток. Показано, например, что активность цитохромоксидазы в ядрах клеток гепатомы понижена; значительно уменьшается и ATP-азная активность ядерной оболочки опухолевых клеток (Збарский и др., 1977). Эти изменения в мембранах ядра вносят, очевидно, свой вклад в перестройку энергетики клеток неоплазмы и в её последствия. Существенным, в частности, может быть изменение регуляции экспрессии генов, связанной с локальными энергозависимыми перестройками хроматина. Некоторые ферментные системы используют энергию гидролиза АТР для указанных перестроек структуры хроматина, делая её доступной для связывания факторов транскрипции (Whitehouse et al., 2000). При устойчивом дефиците АТР такая регуляция будет, естественно, отличаться от происходящей в норме (см. также ниже и п. 2.3.10).

К активному или неконтролируемому синтезу яДНК в опухолях может быть причастно изменение в них концентрации сАМР. Это вытекает из данных о существовании канала для ингибирования тимидинкиназы сАМР-зависимой протеинкиназой и, следовательно, сАМР-зависимого подавления синтеза ДНК (Кульчицкий, 1987). Известно также, что повышение уровня сАМР тормозит включение тимидина в стимулированные к пролиферации лимфоциты и подавляет активность рибонуклеотидредуктазы – фермента, ответственного за продукцию дезоксирибонуклеотидов. Осуществляемое сАМР ингибирование про-лиферации лимфоцитов на пре- и посттрансляционном уровнях характеризуется дозовой зависимостью (Albert et al., 1990). Указанный «тимидиновый» канал пока единственный из известных нам для непосредственного выхода цитоплазматического сАМР на ядерную ДНК, точнее – на процесс её образования. В таком случае снижение уровня сАМР в пролиферирующих клетках неоплазмы должно способствовать активизации биосинтеза ДНК.

По некоторым данным (Федоров и др., 1990), сАМР в комплексе с регу-ляторной субъединицей протеинкиназы А после транслокации в ядро взаи-модействует с промоторными участками генома, активируя или ингибируя экспрессию целого ряда генов. Следовательно, в трансформированных клетках при недостаточном содержании в них сАМР спектр экспрессированных генов только по этой причине будет уже аномальным. Что же касается сАМР-зависимого ингибирования пролиферации на претрансляционном уровне, то один из возможных здесь вариантов механизма, похоже, связан с действием в клетке последовательности процессов: синтез сАМР – повышение интенсивности сАМР-зависимого фосфорилирования фермента 2΄,5΄-олигоаденилатсинте-тазы – возрастание уровня 2΄,5΄-олигоаденилата – активация РНКазы – гидролиз РНК – торможение клеточной пролиферации. Повышению уровня 2΄,5΄-олиго-аденилата способствует также одновременное снижение активности гидролизирующей его 2΄-фосфодиэстеразы. Данный вариант последовательности событий подробно рассмотрен на примере воздействия интерферона на клетки NIH 3T3 (Северин и др., 1998). Как видно, здесь задействована установленная ранее Иткесом и соавт. функциональная взаимосвязь двух важнейших биорегуляторов – сАМР и 2΄,5΄-олигоаденилата. Очевидно, в условиях опухолевой клетки и этот механизм антипролиферативного действия становится нереализуемым или малоэффективным из-за низкого в ней содержания сАМР.

Согласно данным ряда исследований (Алесенко и др., 1982; Кувичкин, 2000), в образовании ДНК-мембранного комплекса участвуют фосфолипиды. Они способны оказывать регуляторное действие на функциональную активность хроматина за счёт изменения конформации ДНК, гистонов и негистоновых белков, изменения гидрофобных взаимодействий между ДНК и белками хроматина. Поскольку в S-фазу содержание фосфолипидов в ядре обычно снижается, предполагают, что они вовлечены в образование сигнальных молекул, запускающих репликацию ДНК (Fraschini et al., 1999). Подробно указанные вопросы рассмотрены в недавнем обзоре (Стручков, Стражевская. 2000), где, в частности, отмечаются и следующие моменты. Специфические ДНК-связанные липиды, среди которых нейтральные преобладают над фосфолипидами, играют важную роль в структурно-функциональной организации хромосомальной ДНК нормальных и опухолевых клеток. Состав этих липидов зависит от фазы клеточного цикла, выраженности генной экспрессии и степени малигнизации. Они участвуют в петлевой укладке ДНК, в её контакте с ядерным матриксом и являются чувствительными мишенями для ионизирующей радиации. Наряду с негистоновыми белками они же задействованы в механизм регуляции процессов репликации, репарации и транскрипции ДНК на уровнях матрицы ДНК или соответствующих ферментов.

Существенно, что в клеточных ядрах локализованы многие ферменты (фосфолипазы и др.), связанные с обменом арахидоновой кислоты, а также липидозависимая РКС, которая фосфорилирует в них регуляторные белки. Ядра, выделенные из моноцитоподобных клеток человека, содержат 22 % общей арахидоновой кислоты данных клеток, причём эта кислота присутствует в разных молекулярных формах фосфолипидов, отличных от арахидонат-содер-жащих их форм в неядерных мембранах (Surette, Chilton, 1998).

При ПОЛ регуляторное действие ядерных липидов будет, очевидно, извра-щено. Наиболее явственно это должно проявиться в случае развития в мемб-ранах радиационно-индуцированных процессов ПОЛ, когда поражение ДНК-мембранного комплекса может быть обусловлено повреждением линкеров, т.е. липидных образований, связывающих субъединицы ДНК на мембране. В результате какая-то часть субъединиц ДНК освобождается, а зависимый от состояния ядерных мембран синтез ДНК снижается (Поливода и др., 1990). В экспериментах in vitro и in vivo на белых крысах показано, что ДНК-полимеразы являются липидозависимыми ферментами. Их активность в значительной степени изменяется при модификации фосфолипидного состава ядер. Путём направленного изменения жирно-кислотного состава липидов ядерных структур установлена их корреляционная связь с изменением функционального состояния ядерного генома (Бабенко, 1984).

Среди других работ, подтверждающих участие фосфолипидов ядерных мембран в транскрипции, отметим результаты исследований Хираи с соавт. (Hirai et al., 1991). Ими показано, что хлорпромазин, верапамил, тетракаин, имипрамин, обладающие сродством к фосфолипидам, и PLA2 ингибировали точную транскрипцию аденовируса 2 в ядерных экстрактах клеток асцитной опухоли Эрлиха. При добавлении же в среду кислых фосфолипидов активность транскрипции восстанавливалась. Хлорпромазин ингибировал транскрпицию на этапе инициации и не влиял на активность очищенной РНК-полимеразы, что предполагает взаимодействие фосфолипидов в ядерных экстрактах с факторами транскрипции. Эти данные привели авторов к выводу: фосфолипиды ядерных мембран участвуют в инициации точной транскрипции. Очевидно, при развитии в этих мембранах ПОЛ, особенно избыточного, указанная функция фосфолипидов будет нарушена, и в первую очередь это проявляется там, где отдельные факторы транскрипции, как отмечается в той же работе (Hirai et al., 1991), имеют сродство к кардиолипину.

Не исключено, что изменения во взаимодействии легкоокисляемых фосфо-липидов с некоторыми факторами транскрипции используются природой в качестве одного из регуляторных актов в переключательной транскриптоно-триггерной системе клетки. Тогда отдельные транскриптоны и целые их комп-лексы могут отключаться путём повышения ПОЛ до некоторого «расчётного» уровня (например, на этапе пролиферации) или активации PLA2 в соответ-ствующие моменты, детерминируемые подсистемой управления клеточным циклом и программой иных подсистем генома. При этом кардиолипин и другие легкоокисляемые фосфолипиды выполняют функцию своеобразного «плавкого предохранителя»: в отсутствии указанных управляющих воздействий они сох-раняют свою целостность и участвуют в инициации транскрипции, при появлении же таковых они «перегорают», и процесс транскрипции просто не начинается.

По указанной причине и вследствие постулируемых нами устойчивых гипероксии и избыточном ПОЛ в опухолевых клетках определённая часть их генома (вероятно, какие-то подсистемы дифференцировки) окажется выключенной, что может быть одной из причин дисдифференцировки этих клеток. Если же учесть возможную тканеспецифичность рассматриваемых регуляторных «устройств» и программ переключений транскриптонов в клеточном геноме, то неизбежным будет и разнообразие структур возникающих неоплазм. К аналогичной «позиционной» регуляции причастен, по-видимому, и кардиолипин, участвующий в суперспирализации петель ДНК при вхождении клеток в интерфазу (Стручков, Стражевская, 1999). При переходе же к окислительному митогенезу способность легкоокисляемого кардиолипина удерживать петли ДНК в суперспирализованном состоянии должна утрачиваться.

Регуляторный смысл модификации фосфолипидного состава ядерных мембран за счёт пероксидации липидов, изменяющейся в норме в допустимых безопасных для клетки пределах, обосновывается работой и ряда других исследователей. В частности, Губский с соавт. (1990) сообщили, что изменение интенсивности ПОЛ в хроматине – один из факторов регуляции функциональной активности генома. Но логика этой регуляции, показанная ими на примере печени крыс, оказалась противоположной рассмотренной нами выше: интенсификация ПОЛ в хроматине совпадала по времени с его структурно-функцио-нальной перестройкой, при этом процессы ПОЛ более интенсивно протекали во фракции транскрипционно активного хроматина, чем в репрессированной фракции. С этим фактом согласуются данные о том, что как активаторы ПОЛ АФК (О, Н2О2) в малых неповреждающих концентрациях активируют транскрипционные факторы (Sen, Packer, 1996; см. также Меньшикова, Зенков, 1997; Пескин, 1997; Кобляков, 1998; Турпаев, 2002). В частности, накопление АФК, индуцированное обогащением клеток (фибробластов человека) различными PUFAs активирует факторы транскрипции AP-1 и NF-kB. Стимулирующий эф-фект PUFAs супрессируется антиоксидантами – витамином Е и N-ацетил-цистеином (Maziere et al., 1999).

Названные выше факты указывают на существование изначально вариантов систем регуляции с противоположными знаками выходного сигнала, адаптированные к выполнению определённых функций внутри клетки и (или) к её специализации. Вообще же, некоторые принципы реализации клеточных регуляторных систем с сигналами противоположной направленности уже известны. Таковы, например, активация и ингибирование аденилатциклазы через разные GTP-связывающие белки, стимуляция и подавление активности разных изоформ PLC кардиолипином (Wolf, 1989). А в книге (Кухарь и др., 1991) приведён перечень биорегуляторов, взаимодействие которых с различными рецепторами активирует или угнетает универсальные аденилатциклазную и полифосфоинозитидную системы. Однако поиски систем регуляции с иными принципами инвертирования выходного сигнала будут по-прежнему актуальными.

АФК, радикальные и молекулярные продукты ПОЛ способны в принципе модифицировать негистоновые белки хроматина, причастные, как принято считать, к регуляции экспрессии генов, и тем самым осуществлять не предусмотренное в норме, «незаконное» перепрограммирование генома, т. е. вести к дисфункции множества генов. Если в такой трансформации негистоновых белков есть элемент случайности, то в общем случае в разных клетках и в различное время нарушение структуры и функции будет затрагивать совершенно разные индивидуальные белки, а сама дисфункция генов будет беспорядочной. Учитывая случайность отдельных актов этого процесса в ряду поколений клеток и упомянутые выше изменения РНК-полимеразной активности при ПОЛ ядерных структур, следует ожидать проявления в динамике непредсказуемых сочетаний характеризующих неоплазии разных признаков. Данные соображения могут быть подробнее обсуждены при анализе и разработке механизма прогрессии опухолей.

2.3.10. Немало работ свидетельствуют и о наличии структурных изменений в самой яДНК и биологических эффектов, вызванных воздействием на неё радикалов О2 и продуктов ПОЛ. АФК способны непосредственно модифици-ровать яДНК, вызывать одно- и двунитевые разрывы этой макромолекулы. В частности, радикал ОН˙ взаимодействует с дезоксирибозой, пуриновыми и пиримидиновыми основаниями ДНК (Осипов и др., 1990). АФК вызывают образование органических пероксидов ROOH, прежде всего липидов и ДНК. Возникающие затем вторичные токсические продукты повреждают мембраны, ДНК и другие биополимеры (см. Кулинский, Колесниченко, 1993). Одним из важнейших продуктов окисления ДНК является 8-OH-dG. Стационарное содержание его в яДНК млекопитающих составляет в среднем 1-3 на 105 гуанинов и повышается при окислительном стрессе (Жижина, Блюхтерова, 1997).

Накопление окислительных повреждений яДНК рассматривается в числе причин сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Флойд (Floyd, 1990), комментируя генотоксическую роль свободных радикалов О2 в канцерогенезе, отмечает опосредованные ими разрывы нити ДНК и включение аддуктов оснований, которые могут вызывать искажение или снижение точности считывания ДНК. ОН˙-индуцированные повреждения ДНК встречаются до образования опухоли и, следовательно, эти окислительные модификации причинно связаны со злокачественным процессом. Подтверждение этой концепции получено при изучении английской камбалы, являющейся частью популяций с низкой встречаемостью рака печени (Malins, Haimanot, 1991).

В последующие годы подобная информация приводилась в литературе неоднократно. Так, действие свободных кислородных радикалов на геномные двухцепочечные молекулы ДНК было сопряжено с образованием 8-гидрокси-гуанина, что часто приводило к нуклеотидным заменам Г→Т. Выявление и количественный анализ индукции этого ДНК-деривата делает его информаци-онным маркёром при анализе уровней и типов мутагенеза и канцерогенеза (Kamiya, Kasai, 1995; Hirano et al., 2000). Повышенные уровни 8-OH-dG обнаружены в ДНК опухолей молочной железы человека (Malins et al., 1993). Образование этого же продукта показано при генерации АФК в ходе микросомной активации тамоксифена и 4-гидрокситамоксифена в присутствии NADPH. Эти процессы, предположительно, участвуют в канцерогенных действиях тамоксифена (Ye, Bodell, 1996).

В одной из работ (Wang, Liehr, 1995) эндогенные аддукты ДНК хомячков индуцированы гидроперекисью липидов, и в этой связи обсуждался возможный механизм канцерогенеза, обусловленный гидроперекисью. Такой эффект вызывает, в частности, образующийся при свободнорадикальном окислении PUFAs (конкретно PUFA ω-6) 4-гидрокси-2-ноненаль. Последний легко образует адду-кты д-гуанозина (Chung F. L. et al., 2000). Канцерогенными и мутагенными свойствами обладает также продукт ПОЛ MDA. Взаимодействуя с ДНК, MDA образует аддукты с д-гуанозином и д-аденозином, главным из которых является пиримидопуринон M1G. Последний обнаружен в печени, лейкоцитах, поджелудочной и молочной железах даже здоровых людей в количествах 1120/108 нуклеотидов ДНК. Полагают, что M1G – главный эндогенный канцерогенный ДНК-аддукт у человека, источником которого служат пищевые продукты (Marnett, 1999).

Сравнение уровня 8-OH-dG в периферической части ткани лёгкого больных раком этого органа (70 чел.) и больных без рака (15 чел.) обнаружило увеличение содержания 8-OH-dG в группе раковых больных. Это подтверждает вовлечение АФК в индукцию лёгочных неоплазм (Inoue M. et al., 1998). Подобного мнения придерживаются Фалаши с соавт. (Falaschi et al., 1997), указывая, что яДНК постоянно претерпевает модификацию под действием различных АФК и активных форм азота in vivo и что окисление/дезаминирование этой ДНК в течение жизни вносит вклад в развитие возрастного рака. Многие факты об 8-OH-dG как маркёре клеточного окислительного стресса при канцерогенезе приведены в ряде работ последних лет, в том числе обзорных (Kasai, 1997; Halliwell, 1999; Romano et al., 2000). Интересен также механизм зависимого от галоидов (HOCl, HOBr) образования ОН˙ активированными нейтрофилами и эозинофилами, приводящий к окислительному повреждению ДНК, РНК, фонда нуклеотидов и, в частности, образованию 8-гидроксигуанина в составе ДНК. Полагают, что этот новый независимый от ионов переходных металлов механизм выработки ОН˙ участвует в процессах хронического воспаления и развитии канцерогенеза (Shen et al., 2000)

В качестве биомаркёров риска развития рака рассматриваются аутоанти-тела, распознающие окисленные нуклеотиды ДНК, такие как 5-гидроксиметил-2′-дезоксиуридин. При воспалительных заболеваниях и при высоком риске развития, в частности, рака молочной железы уровень названных продуктов значительно повышается, выявляясь задолго до клинического проявления болезни (Frenkel et al., 1999). Специально отметим также существенный момент: в повреждении генетического аппарата участвуют и расположенные в непосредственной близости от него редокс-цепи ядерных мембран, образуя в ряде пос-ледовательных реакций О, Н2О2 и ОН˙ (Пескин, 1996).

Повреждение ДНК радикалами ОН˙ и О при канцерогенном действии радиации давно уже подтверждено экспериментально и описано в известной литературе. Есть основания считать, что действие многих химических канцерогенов на геном также опосредуется активацией в клетках процесса образования радикалов О, ОН˙ и продуктов ПОЛ – этих низкомолекулярных генотоксических факторов (Лю, Шайхутдинов, 1991; Byczkowski, Channel, 1996). Кон-центрационно-зависимые повреждения ДНК, оцениваемые по разрывам цепей, вызывались, в частности, метаболитами бензола – 1,2,4-бензтриазолом и гидрохиноном. Оба они способны образовывать О. Максимальный эффект проявлял бензтриазол, приводя к полной деградации ДНК, причём удаление из среды О, Н2О2 и ОН˙ оказывало защитное действие. Другие два метаболита – катехол и бензохинон – не продуцировали О и не индуцировали заметных повреждений ДНК (Lewis et al., 1988).

К существенному усилению окисления гуанина и образование 8-OH-dG в ДНК крыс приводили канцерогены метилхолантрен (см. Жижина, Блюхтерова, 1997) и N-этил-N-гидроксиэтилнитрозамин (Sato M. et al., 1998). При инкубации о-фенилгидрохинона и о-фенилбензохинона, являющихся метаболитами орто-фенилфенола, с клетками китайского хомячка линии V79 происходит значительное возрастание уровня 8-OH-dG в составе яДНК. Оба эти метаболита, вызывая однонитевые разрывы яДНК, могут обусловливать канцерогенность путём индукции выработки АФК (Henschke et al., 2000). В процессе образования опухоли на коже мышей NMPI, индуцированной диметилбензантраценом при участии форболового промотора TPA, в ДНК возникали аддукты 1,N6-этенодезоксиаденозин и 1,N2-этенодезоксигуанозин. Этот процесс тесно коррелировал с up-регуляцией метаболизма арахидоновой кислоты, катализируемого LOX (Nair et al., 2000).

Наконец, отметим здесь и следующие факты. Воздействие на эмбриональные клетки сирийского хомячка акрилонитрилом (50-75 мкг/мл в течение 7 дней), обладающего известными канцерогенными свойствами, приводило к усилению окислительного стресса и накоплению 8-OH-dG. Эти эффекты тор-мозились α-токоферолом (Zhang H. Z. Et al., 2000). Обнаружена отчётливая корреляция между опухолегенезом и образованием 8-OH-dG в ДНК клеток лёгочной ткани у мышей, которым в трахею вводили выхлопные частицы дизеля. Под действием последних в клетках лёгочного эпителия повышается образование перекисей и NO, легко превращающихся, как полагают (Sagai et al., 2000), в пероксинитрит и радикал ОН˙. Табачный дым окружающей среды на рабочих местах индуцировал окислительный стресс у работников, включая образование 8-OH-dG. Накопление последнего в крови человека коррелировало с развитием различных хронических заболеваний, в том числе рака. Под дей-ствием табачного дыма повышались также уровни активности SOD, каталазы и GPX (Howard et al., 1998). Экстракт бездымного табака (125-500 мг/кг) при-водил к возрастанию интенсивности ПОЛ в микросомах и митохондриях, экс-креции MDA и ацетальдегида с мочой, а также числа однонитевых разрывов ДНК у крыс Sprague-Dawley. Эти показатели свидетельствовали об индукции указанным экстрактом окислительного стресса и повреждении ткани у животных (Bagchi M. et al., 1998).

С окислительным повреждением ДНК связывают также уровень жировой диеты, считая такое повреждение маркёром потребления жира человеком и риска развития рака. В доказательство этого сообщается, что у женщин с высоким риском развития рака молочной железы снижение потребления жира на 43 % приводило к трехкратному уменьшению содержания 5-гидроксиметил-урацила в периферийных ядерных клетках крови, причём отмечалась линейная зависимость между потреблением жира и количеством указанного модифицированного соединения в клетках (Djuric et al., 1991). Интересно, что содержание крыс на диете, лишёной холина, приводит к липидной пероксидации во фракциях митохондрий и микросом, а также в ядрах клеток печени, с чем связаны, по-видимому, гибель некоторых печёночных клеток, повреждение ДНК и инициация гепатоканцерогенеза. При включении в рацион холина липидная пероксидация не отмечалась. Введение агента, связывающего свободные радикалы, предотвращало также пероксидацию в ядерной и других фракциях печени, вызванную диетой без холина (Rushmore et al., 1987). Позже сходные результаты получены в другой работе (Denda et al., 1998). Здесь показано, что ингибиторы каскада метаболизма арахидоновой кислоты (ибупрофен, пироксикам, ингибиторы PLA2 и LOX) тормозили образование 8-OH-dG в составе ДНК печени крыс Fischer, развитие цирроза, пред- и неопластических узелков, индуцированных содержанием животных на рационе с дефицитом холина.

Не менее привлекательными, хотя и не совсем пока понятными, представляются материалы эксперимента на крысах, показывающие связь дефицита холина в рационе с нарушением зависимой от NADH (комплекса I) дыхательной функции митохондрий. Нарушение транспорта электронов в митохондриях коррелировало с изменениями в метаболизме фосфатидилхолина и значительным возрастанием выработки Н2О2 в этих органеллах, причём NADH-зависимое образование Н2О2 было повышено в 2.5 раза по сравнению с нормой (Hensley et al., 2000). Не исключено, что одна из причин, ведущая к проявлению указанного эффекта, состоит в возможной дестабилизации при дефиците холина фосфолипидного микроокружения в районе локализации комплекса I на внутренней мембране митохондрий. Однако, независимо от конкретного механизма нарушения дыхательной цепи холиндефицитным рационом, в митохондриях и клетке должны возникать состояние гипероксии и соответственно возрастать уровни АФК, опасные в канцерогенном отношении.

Как видно, наряду с рассмотренными выше эпигенетическими механиз-мами онкогенеза при гипероксии и избыточном ПОЛ генотоксичность АФК, проявляющаяся часто в модификации нуклеотидов и разрывах цепей ДНК (в том числе и путём активации нуклеаз), также каким-то образом «работает» на канцерогенез. Возможно, роль разрывов ДНК на отдельные фрагменты в указанных случаях сводится к созданию условий для: 1) внеплановых изменения их прежней локализации (включая увеличение возможностей и числа вариантов транслокации подвижных генетических элементов), рекомбинации и других перестроек генетического материала; 2) реализации при таких неточечных мутациях бесконтрольной экспрессии некоторых генов и транскриптонов, в частности, тех, которые определяют режим энергетического обмена и функ-ционирование подсистемы управления клеточным циклом. Не без указанных, вероятно, причин активируется синтез продуктов протоонкогенов и (или) образование специфических слитых белков. Обе эти категории белков часто относятся к факторам транскрипции, и изменение качества, содержания и времени их появления искажает «правильный» транскрипционный контроль и нормальную программу функционирования генома, что, несомненно, играет важную роль в этиологии опухолей. Кроме того, возникшие в результате хромосомных транслокаций слитые белки становятся уникальными опухолевыми антиге-нами – потенциальными мишенями для направленной терапии (Rabbitis, 1994).

Таким образом, известная способность некоторых генов индуцироваться под действием АФК, скорее всего, реализуется на транскрипционном уровне (см. п. 1.1.1). При этом происходят АФК-зависимые регуляция активности факторов транскрипции (AP-1, NF-kB и др.) и (или) изменение экспрессии этих факторов (Турпаев, 2002).

В свете изложенного выше представляются важными данные об индукции кислородными радикалами мутаций гена р53 как супрессора опухолей. Изучение влияния комбинации Н2О2 с FeCl3 на мутации этого гена в культивируемых фибробластах кожи человека показало (Hussain et al., 1994): мутации происходят в кодонах 248-250 гена р53, причём спектр мутаций, вызванных радикалами О2, соответствует спектру мутаций, индуцированных такими известными канцерогенами, как афлатоксин В1, бенз(а)пирен и гетероциклические амины. По другой информации, мутацию гена р53 в кодоне 248 индуцируют АФК совместно с соединениями, образующими NO. Это показано, в частности, на эндо-телиальных клетках бронхов человека линии BEAS 2B, которые подвергали воздействию донора NO (название приводится) и системы ксантин-ксантин-оксидаза (Souici et al., 2000). По такому механизму мутации гена р53 могут в принципе происходить и в опухолевых клетках, где для этого созданы подходящие кислородно-перекисные условия и синтезируется NO (см. п. 2.3.2). В дальнейшем мутации гена р53 в кодонах 247 и 248, обусловленные окислительным стрессом, обнаружены в ткани ободочной кишки больных язвенным колитом – хроническом воспалительном заболевании, склонном к опухолегенности. И здесь в указанной ткани больных активность NO-синтетазы была выше, чем в норме (Hussain et al., 2000).

Нам представляется, что из указанных фактов можно было бы сделать два существенных вывода: 1) по отношению к кислородно-перекисной ситуации в клетке мутации гена р53 вторичны; 2) химические канцерогены причастны к тем же мутациям косвенно, через предварительное создание ими дыхательной недостаточности и устойчивого пероксидативного состояния в клетке. Следовательно, при канцерогенезе наряду с неточечными, в основном, мутациями случайного характера в принципе возможны и точечные. Последние применительно к генам супрессии опухолей в каких-то определённых условиях (в частности, при умеренной гипероксии и пероксигенации) могут, по-видимому, возникать более или менее регулярно, способствуя развитию неоплазм. Происходящий в последние десятилетия «информационный взрыв», связанный с широкими ис-следованиями роли гена р53 и механизма действия его продукта, должен внести ясность в обсуждаемый вопрос.

Привлекает также внимание сообщение об исследованиях, в которых показано, что ДНК из клеток инвазивного и неинвазивного рака лёгкого человека различаются по числу вызванных свободными радикалами повреждений, а именно: количество их в клетках инвазивных опухолей в 2 раза больше, причём эти повреждения индуцируются радикалами (пероксидами водорода), генерируемыми самой опухолью (Raloff, 1996). Данные такого рода свидетельствуют, очевидно, о более высоком уровне пероксигенации в инвазивных новообразованиях. Образующиеся в них в избытке АФК, с одной стороны, оказывают токсическое действие на многие внутриклеточные биомолекулы, включая ДНК, а с другой – ведут к ослаблению поверхностных структур клетки и межклеточных контактов, т.е. к изменениям, причастным к инвазивности и метастазированию неоплазм (см. п. 2..4).

Приведённые в п. 2.3.9 и 2.3.10 материалы убеждают в том, что в ядре нормальных и опухолевых клеток реализуются различные АФК-зависимые процессы, связанные, в основном, с регуляцией ферментативного синтеза молекул РНК и ДНК. Проиводство АФК для этих целей, похоже, налажено и в самом ядре (см. Пескин, 1996), причём существует ядерная ферментативная антиоксидантная система, удерживающая свободнорадикальные реакции пероксигенации на необходимом сравнительно низком в норме уровне, защищая тем самым ДНК и хроматин в целом от повреждения (Emerit, 1994; Протас, 1996). О «мощности» этой относительно автономной системы можно судить, например, по тому, что в ядре сосредоточена почти третья часть основных клеточных антиоксидантных ферментов – SOD, каталазы и пероксидазы (Maestro, McDonald, 1989 – цит. по Протас, 1996). Эти ферменты отличаются от митохондриальных и цитоплазматических, а ядерная SOD ассоциирована преимущественно с транскрипционно активным хроматином (Протас, Чаяло, 1993), что косвенно указывает на причастность её к регуляции АФК-зависимого синтеза РНК.

Если в норме регуляция процессов транскрипции и репликации ДНК как-то скоординирована с действием ядерной антиоксидантной системы, то в ядре опухолевой клетки эта согласованность нарушается из-за, как мы полагаем, устойчиво поддерживаемой глобальной внутриклеточной гипероксии. Последняя, несомненно, оказывает своё негативное влияние и на ядерные процессы, в том числе на регуляторные и синтетические, увеличивая в ядре значение дисбаланса ∆ (ПО –АО) путём повышения ПО-составляющей и частичной инакти-вации АО-составляющей его.

С изложенным выше в какой-то мере связаны интригующие результаты исследований по белку BRCA1 цинковых пальцев с неизвестной ранее функцией. Оказалось, что BRCA1 может играть роль в репарации окислительных повреждений в ДНК. Недостаточность этого белка снижает эффективность репарации таких повреждений, повышает чувствительность клеток к действию ионизирующего излучения и перекисных соединений. Более того, мутации в гене BRCA1 ведут к развитию рака молочной железы и яичников (Gowen et al., 1998). Этот интереснейший факт косвенно подтверждает причастность пероксигеназного стресса к нарушению функций яДНК и к самому канцерогенезу.

В последнее время внимание исследователей привлекают также ДНК-гли-козилазы – ключевые, как считают (Рыхлевская, Кузнецова, 2000), ферменты репарации повреждений ДНК, возникающих под действием АФК. Инактивация любого из этих ферментов приводит к спонтанному появлению мутантного фенотипа. Ген ДНК-гликозилазы человека (ген OGG1) кодирует 2 формы белка, причём белок α-OGG1 локализуется в ядре, а β-OGG1 – в митохондриях (Boiteux, Radicella, 2000). Поскольку окислительные повреждения ДНК в опухолевых клетках всё-таки обнаруживаются, это указывает на то, что в них система репарации указанных повреждений становится по каким-то причинам недостаточно эффективной. По-видимому, эта система «рассчитана» лишь на умеренные уровни окислительного стресса, а при повышенном дисбалансе ∆К (ПО – АО) она уже не справляется со своими задачами. Таким образом, в ядре существует сложная защитная система: наряду с антиоксидантной, присутствуют и другие, способные, в частности, исправлять окислительные повреждения в яДНК. В условиях же опухолевой клетки они теряют свою эффективность.

Наконец, уместно отметить, что для ранней диагностики и количественной оценки степени повреждения тканей при патологических состояниях, связанных с избыточной продукцией АФК в организме, предложен высокочувстви-тельный метод. Последний основан на включении в состав клеток исследуемой ткани 32Р после окислительного стресса, разделении азотистых оснований этих клеток и количественном определении содержания продукта окисления гуанозина – 8-OH-dG, причём чувствительность метода составляет 1 молекулу указанного продукта на 106-107 остатков гуанозина в клетке (Povey et al., 1993).

2.3.11. Роль в канцерогенезе теломер и теломеразы и возможность моди-фицирующего действия на них повышенных уровней АФК и ∆ ПО – АО) в предопухолевых и опухолевых клетках – тема, как представляется нам, акту-альная, однако по ней мы не встретили какие-либо убедительные результаты, приемлемые для большинства соответствующих специалистов. По данным ряда исследований, клетки неоплазмы отличаются относительно высокой активно-стью теломеразы. Например, в одной из работ (Yang et al., 1997) активность теломеразы выявлена в 95,2 % образцов раковых тканей желудка и в 54,1 % тканей, прилежащих к опухоли, а во всех образцах нормальных тканей она не обнаружена. В другом исследовании (Hiyama et al., 1998) активность теломеразы определялась в 95 % рака молочной железы и 83 % рака органов пищеварительного тракта, причём длина теломер в них варьировала в широких пределах. По этим фактам сделан вывод о возможности выявления злокачественных и предраковых клеток при заболеваниях различных органов и тканей по активности теломеразы. В опытах на модели химического канцерогенеза кожи мышей показано, что развитие предопухолевого состояния коррелирует с постепен-ным увеличением активности теломеразы. Индукция УФ-облучением опухолей кожи у бесшерстных мышей SKH-1 также сопровождается повышением активности теломеразы на всех стадиях фотоканцерогенеза (Mukhtar et al.,1998), при-чём это повышение ассоциировано с фазой G1 клеточного цикла (Balasubrama-nian et al., 1999). Дефицит теломеразы и дисфункция теломер у мышей, предрасположенных к раку, нарушают у них опухолеобразование, а при введении в раковые клетки теломеразной мРНК соответствующие функции и онкогенный потенциал восстанавливаются (Greenberg et al., 1999).

В опухолевых клетках человека по сравнению с нормальными повышены уровни мРНК теломеразы и самого этого фермента, что обусловлено активацией транскрипции гена теломеразы и/или возрастанием стабильности её мРНК (Yi et al., 1999). Активность теломеразы в большинстве злокачественных опухолей человека и необходимость теломеразного механизма сохранения теломер для длительной пролиферации клеток неоплазм – темы, развиваемые и рядом других исследователей (Rowley, 1998; Urquidi et al., 1998; Holt, Shay, 1999). Однако такому направлению исследований противоречат данные о том, что нокаут гена теломеразы повышает риск развития у мышей различных форм рака вследствие повышения нестабильности генома (Rudloph et al., 1999). Эти материалы – существенный аргумент в пользу существования «нетеломеразных» механизмов поддержания опухолевого роста.

Показательна и такая «деталь»: в опухолевых клетках человека позитивно регулируется ген hEST2 – гомолог генов, кодирующих каталитическую субъ-единицу теломеразы у низших эукариот (Meyerson et al., 1997). Этот ген экспрессируется в первичных опухолях, линиях раковых клеток, в обладающих теломеразной активностью тканях и при иммортализации культивируемых клеток. Напротив, ген hEST2 не экспрессируется в дифференцированных тканях, клеточных линиях с неактивной теломеразой и при дифференцировке клеток in vitro. На основании этих данных предположили, что hEST2 есть ген каталитической субъединицы теломеразы человека. По материалам другого исследования (Hahn et al., 1999), экспрессия мутантной каталитической субъединицы теломеразы человека приводит к полному ингибированию активности этого фермента, уменьшению длины теломеры, ограничению роста и времени жизни раковых клеток. Это делает теломеразу важной мишенью для антинеопластической терапии.

Однозначно сказать о механизме и факторе, приводящем к реактивации теломеразного гена или гена каталитической субъединицы теломеразы в опухолевых клетках пока преждевременно, так как они, скорее всего, множественны. В числе факторов, влияющих на активность теломеразы, указывают, например, концентрацию сыворотки в экспериментах с культурами клеток. В этом аспекте любопытна полученная из клеток аденокарциномы лёгких человека (линия А549) злокачественная сублиния A5DC7, которая обладает пониженной активностью теломеразы и повышенной скоростью укорочения теломерной ДНК (Katakura et al., 1997). При культивировании в среде с 5 %-ной сывороткой эти качества клеток A5DC7 проявляются в полной мере: они приобретают фенотип стареющих клеток и останавливаются в росте после 106 делений. Повышение же концентрации сыворотки до 10 % приводит к активации теломеразы, удлинению теломер и возобновлению пролиферации стареющих клеток A5DC7. Данный пример, как считают авторы, демонстрирует обратимость блока пролиферации в стареющих клетках и двунаправленный (по существу, двухпозиционный) принцип регуляции активности теломеразы в клетках рассматри-ваемой сублинии.

К активации экспрессии гена теломеразы в нормальных и опухолевых клетках могут быть причастны некоторые протоонкогены. Таковым, во всяком случае, считают протоонкоген c-myc (Wang J. et al., 1998). Последний усиливает экспрессию каталитической субъединицы теломеразы в фибробластах и клетках эндотелия молочной железы, увеличивая тем самым продолжительность жизни этих линий клеток. Любопытны также данные о высокой активности теломеразы в опухолевых клетках, обусловленной избыточной экспрессией в них онкобелка bcl-2 (Mandal, Kumar, 1997). Последний известен как антиапоптозное соединение, механизм действия которого пока не совсем ясен. В то же время bcl-2 обладает свойством антиоксиданта (см. п. 7.1.9). Как представляется нам, это важное качество его может иметь непосредственное отношение к повыше-нию теломеразной активности, если учесть возможное прямое или косвенное участие явно избыточного АФК в инактивации теломеразы. Логичным выгля-дит и противоположный эффект, вызываемый действием опухолесупрессорно-го белка ретинобластомы pRb. Так, в клетках плоскоклеточного рака человека уровень активности теломеразы находится в обратной зависимости от содержания белка pRb. Сверхэкспрессия последнего приводит к резкому угнетению ак-тивности теломеразы, а изменение структуры любого из доменов pRb нарушает ингибирующее действие этого белка на теломеразу (Nguyen, Crowe, 1999).

Существует, на наш взгляд, и вероятность того, что реактивация теломераз-ного гена в опухолевых клетках как-то связана с более высокими, чем просто в нормальных стареющих клетках, уровнями рО2, АФК и ПОЛ. Действительно, известны изменение интенсивности ПОЛ в хроматине как один из путей регу-ляции функциональной активности генома и АФК-зависимая регуляция актив-ности факторов транскрипции и/или изменение экспрессии этих факторов при АФК-индуцированной перестройке генетического материала (Меньшикова, Зенков, 1997; Пескин, 1997; Flohe et al., 1997; Numazawa et al., 1997; Simon et al., 1998). Изменение качества, содержания и времени появления факторов транскрипции искажает, естественно, «правильный» транскрипционный контроль и нормальную программу функционирования генома. Косвенно влияние умеренно повышенного уровня АФК на активацию теломеразы проглядывается, на наш взгляд, в следующем факте. При исследовании на мышах с экспериментальными опухолями Colon 26, Metha A и FM3A индометацин, ингибитор синтеза простагландинов (PGs), супрессировал их рост по сравнению с контролем и снижал в них содержание PGE2. Индометацин индуцировал также уменьшение активности теломеразы в указанных опухолях соответственно на 80, 10 и 45 %, но не оказывал влияние на теломеразную активность неопухолевой соматической ткани (Ogino et al., 1999). Можно предполагать, что, ингибируя COX-путь метаболизма арахидоновой кислоты и синтеза PGs как одного из составляю-щих окислительного митогенеза, индометацин тем самым способствует снижению «канцерогенезного» и «пролиферативного» дисбалансов ∆К(ПО – АО) и ∆П(ПО – АО) до уровня, при котором ПО-компонента дисбаланса уже не активирует теломеразу.

Недостаточное содержание сАМР, которое само есть результат повышен-ного уровня ПОЛ, неэффективности энергогенерирующего аппарата и к тому же является фактором пролиферации (см. п. 1.3.4 и 2.1.9), также может стать причиной аномальности спектра экспрессированных генов, поскольку данный циклонуклеотид способен в комплексе с регуляторной субъединицей проте-инкиназы А взаимодействовать с их промоторными участками (см. п. 2.3.8). Онкобелок c-src, являясь нерецепторной тирозинкиназой, тоже активирует определённые факторы транскрипции (Yu et al., 1995). Не исключено, что в опухолевых клетках по какому-то из указанных путей реактивируется и ген теломеразы.

В некоторых работах обращается внимание на парадоксальный факт: несмотря на высокую в раковых клетках активность теломеразы, длина теломерных повторов уменьшается (Kobitsu et al., 1997) и теломеры в них короткие (Ishikawa, 1997; Urquidi et al., 1998). Обратная корреляция между активностью теломеразы и длиной теломер показана, в частности, у больных с В-клеточным хроническим лимфоцитарным лейкозом (Bechter et al., 1998). Так, у этих больных теломеры короче 6,0 т.п.н. ассоциировались с высокой теломеразной активностью, а при длине теломер > 6,0 т.п.н. – в основном с низкой активностью фермента (Р < 0,001). Кроме того, короткие теломеры и высокая активность теломеразы связывались с более низкой средней выживаемостью, что привело к мнению считать активность теломеразы прогностическим маркёром при указанной болезни. Сходные результаты получены при исследовании злокачественных опухолей мозга человека (Hiraga et al., 1998). Здесь также средняя длина терминальных теломер была значительно короче у опухолей с теломеразной активностью, чем у тех, где она отсутствовала. В целом высказано мнение, что теломеразная активность может быть показателем потенциальной или выраженной злокачественности нейроэпителиальных опухолей мозга.

Одно из возможных объяснений приведённых фактов видится в сказанном выше о месте и роли повышенной концентрации АФК в теломерной концепции. С одной стороны, АФК, похоже, причастны к усилению в опухолевых клетках экспрессии гена теломеразы, но с другой – способствуют укорочению теломер, т.е. в данном случае вторая из названных функций АФК «дискредитирует» первую, сводя её результаты почти на нет. В зависимости от соотношения этих, по сути, противоположных действий АФК могут сложиться разные ситуации, в том числе и «неопределённые», как, например, в случае, описанном в работе Леви и соавт. (Levy et al., 1998). Здесь не обнаружена статистически достоверная корреляция между длиной теломер и возрастом как здоровых женщин, так и раковых больных. Старение некоторых тканей (эпителиальных и др.) in vivo не сопровождается укорочением теломер (Kang et al., 1998). По тем же, вероятно, причинам фиксируются и другие факты, склоняющие к мнению: активность теломеразы не всегда (не обязательно) заключает в себе поддержание теломер и бессмертие соответствующих клеток (Ouellette et al., 1999).

Загадочными пока кажутся и данные о том, что некоторые клеточные линии, производные от раков человека, не содержат теломеразы, а их хромосомы имеют удлинённые теломеры (Ezzell, 1995). Сходная информация получена в исследованиях, согласно которым восстановление длины теломер не всегда происходит с участием теломеразы (см. обзор: La Torre et al., 1997; Morii et al., 1997). В этом аспекте любопытны также данные о функции поли (ADP-ри-боза)полимеразы (PARP) в контроле длины теломер и стабильности хромосом. Как отмечают авторы (Di D′adda et al., 1999), PARP участвует в репарации повреждений ДНК и подавлении процессов рекомбинации концов ДНК, и тело-меры как природные концы хромосом являются поэтому потенциальными мишенями для PARP. У мышей с инактивированным геном PARP теломеры короче, чем у мышей дикого типа, но теломеразная активность в мутантных фибробластах in vitro не изменена. Эти факты особенно существенны в свете данных о снижении в период репликативного старения активности систем репарации ДНК, в том числе PARP (Salminen et al., 1997). Возможность регуляции длины теломер по механизму, независимому от теломеразной активности, указывает на ещё более сложные механизмы старения и малигнизации клеток, чем это постулируется теломерной теорией.

2.3.12. С гипероксическими условиями в опухолевых клетках коррелируют большое содержание и резко увеличенный в них синтез PGs, особенно Е ряда (Игнатович, Фрейманис, 1990; Hashimoto, 1998; Mohammed et al., 2001). Напомним, что все известные в настоящее время 10 типов PGs имеют циклопен-тановое кольцо, несущее кислородсодержащие функциональные группы. В зависимости от числа двойных связей в боковых цепях молекулы PGs подраз-деляются на три серии, обозначаемые подстрочными индексами 1, 2 и 3. В организме животных и человека эти биорегуляторы синтезируются из PUFAs с длиной цепи 20 углеродных атомов. Важнейшим биосинтетическим предшественником PGs является арахидоновая кислота, которая высвобождается при гидролизе содержащих её фосфолипидов под действием PLA2.

Превращение свободной PUFA в PG требует присутствия О2, две молекулы которого включаются в одну молекулу кислоты по свободнорадикальному механизму. Очевидно, при гипероксии этот процесс протекает более интенсивно. Увеличение уровня PGs серии Е (PGE) активирует аденилатциклазу, повышает концентрацию сАМР и подавляет рост опухолевых клеток (Anderson, Crowle, 1982). Однако принципиально эти эффекты PGE в трансформиро-ванных клетках лимитируются тем, что активность их аденилатциклазы и её чувствительность к стимуляции PGs понижены. Вероятно, поэтому в клетках гепатомы Йошида PGE2 не оказывает влияния на уровень сАМР (Trevisani et al., 1980). К увеличению синтеза PGs в опухолевых клетках может иметь отношение продуцируемый ими же NO, который, по некоторым данным (McDaniel et al., 1996), сдвигает равновесие метаболизма арахидоновой кислоты в сторону простагландинсинтетазы, ингибируя образование продуктов LOX.

Причиной усиления синтеза PGs в клетках может быть также антиокси-дантная недостаточность в них, обусловливающая пероксидантное состояние. Например, при дефиците витамина Е у крыс синтез PGE2 и PGF2α в их семенниках повышается в 20 раз, а содержание PGE1, PGE2 и PGF2α в плазме крови обратно пропорционально концентрации токоферола. Полагают, что витамин Е тормозит синтез PGs на стадиях образования свободных перекисных радикалов арахидоновой кислоты (Machlin, 1978). В опухолевых клетках указанная ситу-ация усугубляется, так как при повышенном в них уровне ПОЛ активные липидные радикалы наряду с окислением белковых и небелковых SH-групп разрушают некоторые обладающие антиоксидантными свойствами витамины и гормоны. Поскольку эти соединения сами по себе необходимы для нормального протекания внутриклеточных процессов, снижение их содержания может иметь значительные биологические последствия. Одно из них как раз и связано с усилением продукции PGs в условиях недостаточности антиоксидантов.

Кудрявцев (1988), анализируя в своей обзорной работе роль эйкозаноидов в процессах злокачественного роста, приводит ряд интересных фактов. Напри-мер, высокие концентрации PGs обнаруживаются не только в опухолевой ткани больных, но и в плазме крови, моче, злокачественных выпотах, причём содержание PGs в крови по мере удаления кровеносных сосудов от опухоли сущес-твенно снижается. Преобладающей формой эйкрзаноидов в ткани неоплазмы чаще всего является PGE2, концентрация которого иногда в 40-100 раз превышает уровень других эйкозаноидов. А наблюдающееся в биоптатах некоторых опухолей высокое содержание PGF2α связывают с превращением в него PGE2 с помощью 9-кето-редуктазы. Кстати, в большинстве случаев PGF, частности PGF2α, в отличие от PGE проявляют митогенный эффект. Они, как полагают (см. Кухарь и др., 1991), взаимодействуют с рецептором, связанным с полифосфоинозитидным каскадом, а внутри клеток (например, Swiss 3T3) перед вступлением их в митотический цикл индуцируют экспрессию мРНК и белка циклина D1 (Sauane et al., 2000). В условиях in vitro опухолевые клетки сохраняют способность к повышенному биосинтезу PGs и секреции их в значительных количествах в культуральную среду.

Избыточная выработка PGs, в свою очередь, определяет ряд серьёзных нарушений в опухолевом организме. Так, твёрдо установлено подавление противоопухолевого иммунитета PGs серии Е. Высокая концентрация PGE2 в опухолевой ткани ингибирует цитотоксичность макрофагов и естественных киллерных клеток (NK-клеток), низкая же концентрация, напротив, активирует их цитотоксичность (Матвеева и др., 1993; Hubbard, Erickson, 1995). PGE1 угнетает хемотаксис, фагоцитоз и образование АФК нейтрофилами человека (Mikawa et al., 1994). Во всех этих случаях, с учётом других известных фактов (см. п. 2.1), иммунодепрессивный эффект может быть следствием последователь-ности процессов: быстрые синтез и секреция PGs клетками неоплазмы – акти-вация ими аденилатциклазы в NK-клетках и активированных фагоцитах – усиление синтеза сАМР в этих клетках – стимуляция в них сАМР-зависимого митохондриального дыхания и потребления О2 – уменьшение рО2 внутри эффекторных клеток – снижение ими продукции АФК и перекисных соединений – проявление эффекта иммунодепрессии. Независимо и в параллель с указанным механизмом подключается, вероятно, и другой: инактивация NADPH-оксидазы сАМР-зависимой протеинкиназой и гашение «респираторного взрыва» фаго-цитов (McPhail, Snyderman, 1984).

Под влиянием PGE2 практически одновременно с аденилатциклазой активируется также 5′-нуклеотидаза (Балицкий и др., 1991) – фермент клеточной поверхности с характеристиками интегрального мембранного белка, ответственный за гидролиз внеклеточного AMP и транспорт образующегося аденозина в клетку. Аденозин же известен тем, что увеличивает содержание сАМР в клетках многих типов и ингибирует функциональную активность иммунокомпетентных клеток, в том числе Т-лимфоцитов и мононуклеарных фагоцитов (Si et al., 1997; Xaus et al., 1999). Поэтому вполне реальным представляется функционирование наряду с указанным выше ещё одного механизма противодей-ствия опухолевых клеток эффекторным, а именно: синтез клетками неоплазмы PGEs – активация 5′-нуклеотидазы на поверхности NK-клеток и макрофа-гов – повышение в них уровня аденозина и сАМР – подавление активности NK-клеток и макрофагов, в том числе продукции ими АФК.

С позиций указанных механизмов причастность высоких уровней PGEs к процессу развития, например, рака желудка человека в качестве одного из непосредственных факторов этого патогенеза (Степанов, 1999) представляется несколько сомнительной. Скорее всего, PGEs способствуют развитию неоплазм косвенно через иммунодепрессию, а ингибитор синтеза PGs индометацин сни-жает подавляющее их действие на иммунный ответ организма-хозяина, длительно поддерживает цитотоксическую активность мононуклеарных фагоцитов и NK-клеток. С данной точки зрения возможна интерпретация таких, в частности, фактов. Если при скармливании природным канцерогеном 1-гидроксиан-трахиноном опухоли толстой кишки возникали у 44 % крыс-самцов, а опухоли желудка – у 52 %, то добавление к канцерогенной диете индометацина приводило к следующему: опухоли толстой кишки не наблюдались вообще, частота же опухолей желудка снижалась до 14 %. Кроме того, индометацин полностью подавлял возникновение гапатом, индуцируемых канцерогеном. (Tanaka et al., 1991). В исследованиях на мышах с экспериментальными опухолями Colon 26, Metha A и FM3A индометацин (доза 1 мг/кг, 2 раза в день) значительно снижал содержание PGE2 и супрессировал рост всех трёх опухолей по сравнению с необработанным контролем (Ogino et al., 1999).

Скармливание хомячков, носителей меланомы, индометацином с питьевой водой приводило к увеличению цитотоксической активности NK-клеток крови и понижению частоты возникновения метастазов почек (Bigda, Mysliwski, 1998). Добавление к такой же воде для мышей С57/В16 индометацина в концентрации 2 мг/мл в течение 4 дней вызывало снижение продукции PGE2 в изолированных и культивируемых срезах мозга с 98,6 до 57,6 пг/мг и активацию микроглии, т. е. в данном случае даже в неопухолевых тканях. Считают, что именно ингибирование синтеза PGE2 под действием индометацина приводит к активации иммунной системы мозга (Prechel et al., 2000). В перитоне-альных и альвеолярных макрофагах мышей с метастазирующей карциномой лёгких Льюис активность 5′-нуклеотидазы и концентрация аденозина возрастали по сравнению с контролем, что подавляло фукнциональную активность мак-рофагов. Подобное изменение в обмене аденозина обнаружено и в альвеолярных макрофагах больных раком лёгкого. Введение же мышам с карциномой Льюис активатора макрофагов (бактериального эндотоксина E. coli липополи-сахаридной природы) приводило к значительному торможению роста мета-стазов и восстановлению нарушенного обмена аденозина в перитонельных и альвеолярных макрофагах (Уманский и др., 1988).

Рассмотренные выше механизмы иммунодепрессорного действия PGEs и других факторов, повышающих уровень сАМР, в какой-то степени реализу-ются, по-видимому, и на эффекторных клетках специфического противоопу-холевого иммунитета. Поэтому в целом представление о существовании «простагландинового» механизма защиты опухолевых клеток от атак эффекторных клеток не лишено оснований.

Наконец, определённый интерес вызывает недавняя публикация о способности простагландинов серии J2 (PGJ2), являющихся производными PGD2, действовать как индукторы окислительного стресса. Прооксидантный эффект их в отношении, например, клеток нейробластомы SH-SY5Y человека проявлялся в том, что снижались активность GPX, концентрация GSH и мембранный потенциал митохондрий, накапливался продукт ПОЛ 4-гидрокси-2-ноненаль. N-ацетилцистеин же ингибировал стимулированную PGJ2 генерацию АФК (Kondo et al., 2001). С точки зрения кислородно-перекисных концепций канцерогенеза и апоптоза, PGJ2 в указанном качестве может способствовать апоптозу А1 или опухолевой трансформации нормальных клеток, а в опухолевых – поддерживать «канцерогенезный» уровень дисбаланса ΔК (ПО – АО) или повысить в них этот дисбаланс до индуцирующего апоптоз А2 (см. п. 7.1).