Морфологические методы исследования

Биоптаты слизистой оболочки антрального отдела желудка фиксировали в 10% нейтральном формалине по Лилли, осуществляли проводку по спиртам возрастающей концентрации, инкубировали в хлороформе, парафине, заливали в парафин.

При проведении исследований использовали следующие методы:

• гистологическая оценка слизистой оболочки желудка

• аргирофильный метод Гримелиуса для общей идентификации популяции нейроэндокринных клеток

• иммуногистохимические методики с использованием антител

к пролиферативному ядерному клеточному антигену (PCNA) и р53

Микроскопические исследования проводили в световом микроскопе Nikon Eclipse Е400.

Для гистологической оценки срезы биоптатов толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином, эозином, альциановым синим.

Оценка гистологическая структуры слизистой оболочки желудка проводилась согласно «Модифицированной Сиднейской системы классификации и градации гастрита» (1996) с использованием визуально­аналоговой шкалы. При описании гистологического препарата морфологические изменения оценивались полуколичественно

(слабые, умеренные, выраженные) с указанием следующих признаков:

• нейтрофильная инфильтрация

• лимфоплазмоцитарная инфильтрация

• атрофия

• кишечная метаплазия (с указанием её типа)

Наличие в клетках слизистой оболочки желудка маркеров апоптоза (протеина р53) и пролиферации (PSNA) определяли на парафиновых срезах авидин-биотиновым иммунопероксидазным методом с использованием мышиных моноклональных антител фирмы Novocastra, clone DO-7

в разведении 1:40 для выявления р53 и clone РС-10 в разведении 1:300 для PSNA. Проводилась высокотемпературная демаскировка антигена в цитратном буфере.

Количественные морфологические исследования выполнены с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений Nikon АСТ-1 версия 2.12 с использованием программы ВИДЕОТЕСТ МОРФОЛОГИЯ версия 4.0.

Производилась оценка следующих структур слизистой оболочки желудка:

• клеток воспалительной инфильтрации (лимфоцитов, плазмоцитов, нейтрофилов) с подсчётом их общего количества и процента занимаемой ими площади в поле зрения при увеличении *200

• общего количества нейроэндокринных клеток, процента занимаемой ими площади, величины их оптической плотности при увеличении *400

• пролиферативной активности клеток по степени иммуногистохимической экспресии PCNA с подсчётом процента занимаемой площади и оптической плотности при увеличении *400

• апоптоза по степени иммуногистохимической экспресии р53

с подсчётом процента занимаемой площади и оптической плотности при увеличении *400

Относительная площадь экспрессии даст представление о пространственном распределении изучаемых факторов. Оптическая плотность (единицы яркости) отражает концентрацию исследуемого биологического продукта в объекте по яркости окрашивания и свидетельствует об активности изучаемого явления.

Подсчет соответствующих структур проводили в 3 полях зрения, после чего вычислялась средняя величина.

2.5