4.2. Основные положения кислородно-перекисноймодели «спонтанной» малигнизации



При разработке новой концепции канцерогенеза необходимо учитывать все материалы, касающиеся постепенного изменения характеристик и малигни-зации нормальных клеток в условиях in vitro, поскольку в них содержится достаточно серьёзная информация.
Наша глобальная задача – обосновать, по возможности, представление, согласно которому в основе всех видов кан-церогенеза, включая и «спонтанную» трансформацию клеток вне организма, находится какой-то единый механизм, и таковым, скорее всего, является кис-лородно-перекисный.
4.2.1. Изучение известных на сегодня способов культивирования в моно-слое показало, что все они проводятся при атмосферном давлении и, следо-вательно, при рО2, значительно превосходящим значения, которые имеют место в организме в норме. Условия культивирования таковы, что через тонкий слой синтетической питательной среды к однослойным клеткам в сосуде свободно диффундируют молекулы О2 и внутри них устанавливается высокое рО2, невозможное in vivo или, во всяком случае, превышающее допустимые зна-чения. Обычно клетка находится под слоем инкубационной жидкости, рО2 в которой близко к рО2 воздуха.
С точки зрения развиваемой нами концепции канцерогенеза, постулирую-щей необходимость создания в клетке состояния устойчивой гипероксии и избыточной пероксидации для опухолевой трансформации и её поддержания (см. главу 2), трудно представить более подходящие естественные бластомо-генные условия, чем создаваемые в монослойных культурах. По-видимому, сама гипероксическая обстановка в них «подготавливает» клетки культуры к спонтанной трансформации и приближает их к этому событию, поскольку скорость образования активных форм О2 и, следовательно, интенсификации ПОЛ мембран находятся в прямой зависимости от рО2 (Fridovich, 1975; Turrens et al., 1982). Именно такая подготовленность, на наш взгляд, может лежать в основе феномена высокой чувствительности культуральных клеток к действию различных химических канцерогенов. Следствием этого являются быстрота и массовость (высокая частота) злокачественного превращения клеток в монослое под влиянием указанных канцерогенов (Гершун и др., 1982). Кроме того, высокий процент малигнизированных клеток обусловлен здесь, по-видимому, и тем, что в условиях культуры не проявляется мобилизация антиоксидантной системы защиты, которая в целом организме играет, как известно, важную роль в подавлении предраковых очагов.
Существенно также, что к повышению в клетках культуры уровня дисба-ланса ∆ (ПО – АО) до соответствующего «канцерогенному» диапазону ∆К (ПО – АО) может способствовать и тепло, т. е. постоянно действующий фактор окружающей среды. Как было показано с помощью высокочувствительного метода (описание его приводят авторы Брусков и др., 2001), в результате тепловой активации растворённого в воде атмосферного О2 протекает после-довательность реакций
О2 → 1О2 → О → НО2˙ → Н2О2 → ОН˙.
Образующиеся при таком содействии тепла АФК причастны, очевидно, к созданию необходимых для трансформации клеток и устойчивого её поддер-жания пероксигеназных условий. Тепловой фактор выступает здесь как, своего рода, «катализатор» – активатор и усилитель потенциальных окислительных возможностей гипероксии. В условиях же гипоксии тепловая активация О2 будет, естественно выраженной слабо.
Перечисленные в п. 4.1 изменения в малигнизируемых клетках объяснены нами в главе 2 с позиций общей кислородно-перекисной концепции онкогенеза. Канцерогенные условия гипероксии и пероксидации внутри трансформируемой клетки представлялись там как вторичный эффект, как следствие предвари-тельного первичного нарушения канцерогенными факторами антиоксидантной системы защиты клетки и, прежде всего, её антикислородной ступени (мито-хондриального дыхания). Однако in vitro те же изменения в клетке предстают теперь как первичный эффект естественно существующей, постоянно и непосредственно действующей гипероксии. Следовательно, в этом случае нет необходимости в искусственном создании гипероксии путём предварительного воздействия истинными канцерогенными факторами, которые обязательны для инициации большинства видов неопластической трансформации, но не сущес-твенны для спонтанной малигнизации. В этом и заключается особенность бесканцерогенного механизма перерождения клеток в культуре.
Условия культивирования и главным образом обусловливаемые ими гипер-оксия и пероксигенация сначала оказывают угнетающее действие на субкле-точные элементы, на физиологические и метаболические процессы, в резуль-тате чего начальный период жизни этих культур характеризуется постепенным затуханием энергии роста. Так, при плотности посева от 0,005 до 2·104 кл/см2 рост диплоидных фибробластов человека прогрессивно ингибировался при рО2 > 140 мм рт. ст. Полагают, что О2 действует на клетки непосредственно, а не путём разрушения каких-то компонентов среды (Arthur et al., 1984). К прек-ращению роста тех же фибробластов в культуре в конце периода их пролифе-ративной жизни может иметь отношение и опухолесупрессорный белок р53.
Косвенно это доказывается разными способами, в частности, инактивацией р53 в стареющих клетках путём микроинъекции в них моноклональных антител к р53. Эти антитела индуцируют вступление стареющих клеток в S-фазу и про-хождение всех других фаз клеточного цикла, что сопровождается реверсией к «молодому» морфологическому фенотипу клеток (Gire, Wynford-Thomas, 1998). Однако по истечении указанного, вероятно, адаптационного периода, в ходе которого происходит отбор наиболее приспособленных к гипероксии клеток, постепенно вступает в силу упомянутый выше кислородно-перекисный меха-низм канцерогенеза, который и приводит к спонтанной малигнизации. К тому же, в условиях длительной гипероксии и значительного избытка АФК могут мутироваться ген р53 (Hussain et al., 1994; Shen, Ong, 1996; Souichi et al., 2000) или посттрансляционно инактивироваться функции онкобелка р53 (Cobbs et al., 2001), что увеличивает вероятность перехода отдельных клеток культуры в состояние неконтролируемого роста. Эти обстоятельства позволяют понять тот факт, что трансформация клеток, за редким исключением, наступает лишь после длительного культивирования.
Характерный в рассматриваемом аспекте материал представлен в давней работе Мика и соавт. (Meek et al., 1980). В культуре клеток 15-17-суточных эмбрионов крысы снижение пролиферативной способности сохранялось до 9-го пассажа, причём методом замедленной микрокиносъёмки обнаружены увели-чение неделившейся фракции клеток и удлинение межмитотического периода. Примерно на 10-м пассаже произошла трансформацию в клеточную линию с неограниченным ростом, быстро повысились скорость пролиферации и доля клеток, включающих 3Н-тимидин. Однако они оставались диплоидными и не приобретали опухолеобразующую способность до 20-го пассажа.
Аналогичные данные изложены в другой работе (Kraemer et al., 1983), авторы которой наблюдали спонтанную опухолевую эволюцию в культуре кле-ток эмбрионов китайского хомячка в виде многоэтапной прогрессии фенотипа. Между 5-м и 12-м пассажами темп пролиферации клеток снижался, наступало старение их, и при малой плотности насыщения образовались регрессирующие колонии. После этого «кризиса» выявлялись быстро пролиферирующие клетки, образующие стабильные линии. Исследователи выделяют 4 стадии в возникно-вении опухолеобразующей способности: первая (1-12-й пассажи), когда клетки не обладают такой способностью и большинство из них стареет; вторая (13-29-й пассажи), когда клетки ещё не способны к опухолеобразованию, но могут неограниченно делиться in vitro; третья (30-50-й пассажи) – клетки образуют опухоли при введении в предварительно имплантированную желатиновую губку, успевшую к этому моменту васкуляризоваться; четвертая (более 50 пассажей) – клетки образуют опухоли при непосредственной имплантации.
Если в период упомянутой выше адаптации клеток изменить условия куль-тивирования путём перехода к искусственной газовой среде с низким рО2, то угнетающее действие гипероксии на эти клетки, естественно, исчезнет или снизится. Действительно, количество выживаемых колоний кроветворных кле-ток мыши при рО2 в газовой фазе 48 мм рт. ст. (вместо обычных 135 мм рт. ст. при культивировании) значительно увеличивается. В этих же условиях улучша-ется рост эмбриональных фибробластов мыши, причём в некоторых опытах прирост их был в 10 раз выше в сравнении с обычным культивированием при 18 % О2 в воздухе (Bradley et al., 1978). При снижении содержания О2 в среде до 1,6 или 12 % у диплоидных фибробластов IMR90 человека с различными исход-ными уровнями удвоения популяции увеличивается период пролиферативной жизнеспособности. Этот период при 1 % О2 возрастает на 22 %, а возвращение культур из среды с 1 % О2 в среду с 20 % О2 быстро развивает их старение (Saito et al., 1995). Возрастание лимита Хейфлика при 1-3 % О2 в газовой среде для культивирования и, напротив, снижение его в условиях оксистресса пока-зано и в ряде других работ (Chen et al., 1995; Von Zglinicki et al., 1995).
Из числа сходных публикаций последних лет можно отметить исследова-ния, проведённые на первичных культурах мезангиальных клеток почечных клубочков крысы. В условиях 28-часовой хронической гипоксии (3 % О2) в этих клетках возрастало включение 3Н-тимидина, а через 72 ч увеличивалось число клеток по сравнению с культурами, растущими в условиях нормоксии. Интере-сен и другой факт: гипоксия вызывала транслокацию PKC из цитозоля в мемб-раны и активацию этого фермента, ингибитор же PKC предотвращал индуци-рованное гипоксией увеличение скорости пролиферации (Sahai et al., 1997). Более существенные результаты получены при культивировании мезенхимных стволовых клеток из костного мозга 6-12-недельных крыс F-344 в атмосфере 5 % О2 + 5 % СО2 + 90 % N2 (опыт) и 95 % воздуха + 5 % СО2 (контроль). В опытных культурах формировалось большее число колоний, клетки пролифери-ровали быстрее, а содержание ДНК в них было выше, чем в контроле. Клетки этих культур продуцировали больше костной ткани при пересадке их в порис-тых керамических носителях сингенным реципиентам. Кроме того, экспрессия маркёров остеогенной дифференцировки повышалась при замене атмосферы с высоким содержание О2 на «опытную» и, наоборот, снижалась при обратной замене атмосферы культивирования. Итак, клетки in vitro действительно функ-ционируют оптимальнее в условиях пониженного содержания О2, которые больше соответствуют устанавливающимся in vivo (Lennon et al., 2001).
Цитотоксическое действие гипероксических условий культивирования на клетки можно частично уменьшить путём стимуляции митохондриального дыхания и снижения тем самым внутриклеточного рО2. Эта цель может быть достигнута, например, с помощью cAMP, который как раз и является одним из таких стимуляторов (см. п. 2.1.9). Если исходить из данного представления, то становятся понятными следующие результаты. Через 5 дней культивирования нейронов, изолированных из фрагментов среднего мозга 14-дневных эмбрионов крыс, выживало 90 % клеток в случае, когда в используемые для приготовления клеточной суспензии растворы добавляли 700 мкМ дибутирил-cAMP. В конт-роле же, без добавления cAMP, таковых было лишь 40 % (Branton et al., 1998).
Неадекватность внутриклеточной антиоксидантной системы гипероксичес-ким условиям жизни вне организма подсказывает исследователям и другие пути предотвращения быстрого старения и деградации культивируемых клеток, в частности адаптационный, за счёт приведения «материальной базы» антиокси-дантной системы в соответствие с возросшим уровнем рО2. Поразительные в этом отношении факты приведены в работе Велка с соавт. (Valk et al., 1985). В результате постепенной адаптации к возрастающим концентрациям О2 полу-чена линия клеток яичка китайского хомячка, устойчивая к высокому содер-жанию О2 и способная пролиферировать при 99 % О2 и 1 % СО2. Контрольные клетки в таких условиях погибали. Адаптировавшиеся клетки отличались от исходных. Объём фракции митохондрий в них возрастал в 1,8 раза, причём увеличивались как количество митохондрий, так и их размеры. Объём фракции пероксисом увеличивался вдвое: в 1,9 раза возрастало их количество и в 1,2 раза они увеличивались в размере. Удельная активность Cu,Zn-SOD увеличи-валась в 2,5 раза, Mn-SOD – в 2,1 раза, каталазы – в 4 и GPX – в 1,9 раза. Кроме того, количество липидных капель в них было больше, а скорость роста клеток несколько снижена. Все эти существенные приспособительные изменения вполне объяснимы: увеличение «мощностей» митохондриального дыхания и пероксисомального окисления (одной из форм дыхания пропорционально нап-ряжению О2 в клетке), означает усиление в составе антиоксидантной системы клетки антикислородной линии защиты и как следствие снижение внутрикле-точного рО2; с повышением активности SODs, инактивирующих О, возраста-ет эффективность антирадикальной линии защиты; увеличение же активности каталазы и GPX, естественно, усиливает антиперекисную ступень защиты.
Указанная адаптация клеток к гипероксии и пероксидации, очевидно, дол-жна обеспечить высокую устойчивость их к токсическому действию О2, АФК и перекисных продуктов, а также резистентность к малигнизации на последую-щих стадиях. Конкретный механизм такой адаптации неизвестен. Возможно, здесь для митохондрий действуют О2-и АФК-зависимые механизмы регуляции количества дыхательных ферментов (Murphy et al., 1984; Suzuki H. et al., 1998), согласно которым при гипероксии их число должно постепенно нарастать. Представляется, что рассмотренный и другие подобные феномены связаны с амплификацией определённых генов ядра и митохондрий, причём в норме этот процесс индуцируется при установлении, по-видимому, лишь умеренных гипероксии и ПОЛ в достаточно узких пределах их изменения, но способен, судя по работе Велка и соавт. (см. выше), постепенно адаптироваться и нейтра-лизовать действие и более высоких, токсических уровней внутриклеточного рО2 и пероксидации. Реализация сказанного наглядно демонстрируется фактом амплификации генов каталазы при хроническом воздействии (более 200 дней) на фибробласты китайского хомячка возрастающих концентраций О2 или Н2О2. В результате такого воздействия получен резистентный к окислительному стрессу фенотип: клетки его обладали в 20-30 раз более высокой активностью каталазы, чем родительские, и в них найдено 4-6-кратное увеличение числа копий генов каталазы (Hunt et al., 1998).
Предполагаемая причинная связь между неадекватностью газовой среды и спонтанной малигнизацией в условиях культуры может быть проверена постановкой простых экспериментов. Из теории этого вопроса, в частности, следует, что культуры клеток и тканей, растущие при рО2 не выше тех, которые характерны для соответствующих нормальных тканей внутри организма, не должны малигнизироваться. Действительно, 1-2 % содержание О2 в газовой среде не индуцирует и не стимулирует спонтанное неопластическое превраще-ние клеток эмбриона генетически однородной высокораковой линии мышей C3Hf. Высокое же содержание О2 (40 %) не предупреждало и не задерживало указанного превращения (Sanford, Parshad, 1968).
С этой же точки зрения, различные виды антиоксидантов также относятся к антиоксистрессорным и антитрансформирующим факторам. Так, воздействие витамином Е на культивируемые клетки микроглии коры головного мозга новорожденных крыс Wistar обеспечивало выживаемость их до 7 суток. А боль-шинство контрольных клеток (до 81,5 %) погибало к этому сроку, не выдер-живая определяемого условиями in vitro окислительного стресса (Heppner et al., 1998). Кстати, цитотоксическое действие данных условий можно усилить, если обеспечить клетки в достатке соответствующими субстратами, в частности PUFAs, «сжигание» которых будет усугублять в них токсическое пероксиге-назное состояние. Примером здесь мог бы служить тот факт, что длиноцепо-чечные n-3 и n-6 PUFAs (50 мкМ) подавляли рост и пролиферацию в монослое уроэпителиальных клеток, полученных из мочевого пузыря здорового человека (Diggle et al., 2000).
Развиваемые нами положения, несмотря на отсутствие сегодня более «тонких» доказательств, кажутся достаточно очевидными и поэтому должны быть приняты во внимание при разработке общего механизма неопластической трансформации клеток. Здесь же мы ограничимся пока «алгоритмом» возмож-ных различных эффектов, детерминируемых содержанием О2 в культуральной среде (рис. 21).
4.2.2. Изложенным представлениям, казалось бы, противоречат данные упоминавшейся выше давней работы (см. Goldblatt, Cameron, 1953). Создавая кислородное ограничение, авторы её экспериментально вызывали раковое перерождение фибробластов сердца, выращиваемых в культуре ткани в течение 2,5 лет. Однако для правильной интерпретации полученных ими результатов необходимо учесть то существенное обстоятельство, что на протяжении ука-занного срока культуры находились в состоянии анаэробиоза не постоянно, а лишь периодически. В контрольной культуре, не подвергавшейся периоди-ческому лишению О2, опухолевые клетки не возникали. На фоне этого различия аноксия, на первый взгляд, безоговорочно выступает здесь как главный фактор
Предотвращение трансформации части клеток за счет дальнейшего адаптивного наращивания антиоксидатной системы их и поддержания в них низких значе-ний D(ПО-АО) при постепенном и мед-ленном переводе этих клеток на искус-ственно создаваемые условия с высоким содержанием О2 в среде культивирова-ния (40-99%) за счёт дальнейшего адаптивного наращивания атиоксидан-тной системы этих клеток и поддержа-ния в них низких значений Δ(ПО–АО)
Злокачественное перерож-дение адаптировавшихся клеток по кислородно-перекисному механизму
Рис.21. Бесканцерогенная «спонтанная» малигнизация и другие эффекты при различных уровнях рО2 в среде культивирования
малигнизации. В действительности же истинная роль периодической аноксии может быть совсем иной.
Скорее всего, в условиях недостатка О2 митохондрии в клетках культуры ткани постепенно деградируют, часть дыхательных ферментов в них утрачива-ется в соответствии с О2-зависимым механизмом регуляции количества этих ферментов (Murphy et al., 1984). Уместно здесь сослаться на данные об уменьшении содержания цитохромов b, c, c1 и a + a3 в митохондриях и цитохромов b5 и CYP в микросомах лёгких и печени крыс, подвергнутых резкой гипоксии – выдерживанию их при 290 мм рт. ст. и 32оС в течение 6 ч (Srivastava et al., 1980). Гипобарическая гипоксия создавалась имитацией под-ъёма на высоту 7500 м, а о деградации цитохромов судили по высоте пиков на спектрах ЭПР. Полученные результаты означают, что периодическая аноксия каждый раз создает в клетках необходимые условия для усиления гипероксии и свободнорадикальной пероксидации при последующем устранении кислород-ного голодания.
Ввиду принципиальности данного вопроса и в подтверждение изложенных только что суждений рассмотрим ещё некоторые другие работы, хотя и не имеющие прямого отношения к проблеме канцерогенеза. Так, Джафаров (1981), исследуя закономерности накопления продуктов ПОЛ при инкубации в вы-деленных из печени крыс Wistar клеточных органеллах (митохондриальной, микросомальной, ядерной и лизосомальной фракциях), перенёсших аноксию в различных условиях, получил, на наш взгляд, заслуживающие внимания резуль-таты. Внутритканевая аноксия (её вызывали наложением лигатуры на сосудис-тую ножку печёночной дольки на 30 мин) приводила к нарушению структуры клеточных органелл в разной степени, которое проявлялось усилением ПОЛ при последующей аэробной инкубации. При внетканевой аноксии (её создавали выдерживанием изолированных клеточных органелл в атмосфере инертного газа в течение 30 мин) и последующем переживании в аэробных условиях заметная интенсификация ПОЛ отмечена только у митохондрий. По сравне-нию с другими органеллами у митохондрий были повышенная скорость ПОЛ и раннее достижение его максимума, что свидетельствовало о «наибольшей чувствительности как при внутритканевой, так и внетканевой аноксии и о подверженности их окислительной деструкции ранее других органелл».
Исследования Шилда и соавт. (Schild et al., 1997) подтверждают: при гипок-сии - реоксигенации изолированных митохондрий печени крысы происходят нарушение стимуляции дыхания добавлением ADP, окислительная модифика-ция белков митохондрий, ПОЛ и образование MDA в этих органеллах. Водо-растворимые антиоксиданты защищают митохондрии от стресса, индуцирован-ного последовательностью процедур гипоксии и реоксигенации. Эти данные подтверждены в последующей их работе (Schild et al., 1998), где показано накопление и других маркёров окислительного стресса, происходившее одно-временно с нарушением дыхания митохондрий и снижением трансмембранной разности потенциалов на внутренней их мембране. Выраженность этих эффек-тов зависела от продолжительности пребывания как в состоянии гипоксии, так и в периоде реоксигенации.
Интактные митохондрии, изолированные из сердец молодых (3 мес.) крыс, могут генерировать О и другие производные от него токсичные АФК лишь в присутствии антимицина А – специфического ингибитора электронного транс-порта, процедура же кратковременной аноксии и последующей реоксигенации таких митохондрий превращает их в интенсивные генераторы О в отсутствии антимицина А. Методом ЭПР показано, что «в результате аноксии/реоксигена-ции возрастает реакционная способность убисемихиноновых радикалов дыха-тельных путей к автоокислению кислородом, вследствие чего повышается гене-рация О как побочных продуктов нормального дыхания» (Кольтовер, Ноль, 1992). По данным этих же авторов, митохондрии из сердец старых животных генерируют О и в отсутствии антимицина А, отличаясь повышенной автооки-сляемостью убисемихинонов в интактном состоянии. Эти изначальные качества митохондрий старых животных коррелируют с ухудшением биоэнергетических характеристик, что указывает на повреждение данных органелл. Очевидно, в клетках с подобной недостаточностью митохондриального дыхания возникает состояние относительной гипероксии и связанное с ним избыточное перекис-ное окисление, т. е. условия для прогрессивного старения клеток (см. п. 1.3) и последующей трансформации некоторых из них в опухолевые.
Столь отличительное поведение митохондриальной фракции в условиях аноксии - реоксигенации определяется, несомненно, какими-то специфичес-кими биохимическими процессами, структурными и функциональными особен-ностями этих органелл. Среди них можно отметить следующие. При аноксии вследствие резкого снижения окислительного фосфорилирования и падения разности потенциалов на внутренней мембране митохондрий происходит выход в цитоплазму ионов кальция, которые в норме удерживались во внутреннем их пространстве (матриксе). «Попутно» Са2+ активирует PLA2, локализованную на наружной стороне внутренней мембраны митохондрий (Сороковой, Владими-ров, 1975). Наиболее ранние повреждения в митохондриях при аноксии связаны именно с действием этой фосфолипазы, причём расщепление молекул фосфо-липидов и накопление свободных жирных кислот – одна их главных причин усиления ПОЛ при переходе в аэробные условия. Деструктивную работу выполняет и протеиназа, выделенная из межмембранного пространства мито-хондрий. Этот фермент селективно разрушает полипептиды их внутренней мембраны и ингибируется ATP (Duque-Magalhaes, Gualberto, 1987). Следова-тельно, при аноксии и соответственно при дефиците ATP степень митохон-дриального протеолиза должна возрасти.
Кроме упомянутых выше, причинами сильной и быстрой подверженности мембран митохондрий ПОЛ при последующей аэробной инкубации являются: высокое (до 40 %) содержание в них липидов, главным образом фосфолипидов, потенциально склонных к повышенному перекисному окислению; необходи-мость фосфолипидов высокой степени ненасыщенности и, в частности, легко окисляемого кардиолипина (Fry, Green, 1981) для осуществления каталитичес-ких функций дыхательных ферментов и сопряжения электронотранспортных процессов.
Поэтому уже в начальном периоде развития ПОЛ автоматически снижает действие дыхательной цепи, создает внутри митохондрий гипероксию и тем самым усугубляет пероксидативную ситуацию.
Сходные с рассмотренными выше факты приведены в работе Литвицкого и соавт. (1981). При недостатке О2 дистрофические изменения, пропорциона-льные длительности аноксии, первоначально развиваются в митохондриях. Декомпозиция мембранных структур клетки наступает только после деструк-ции митохондрий, причём сначала переокисляются ненасыщенные жирные кислоты цитозоля и лишь затем фосфолипиды мембран. Такая последователь-ность изменений неслучайна и согласуется с дестабилизирующими действи-ями фосфолипазы и протеиназы митохондрий при аноксии и созданием ими условий для последующей интенсификации ПОЛ. Поэтому вывод о первич-ности нарушения структуры биомембран с пространственной дезорганизацией его белково-липидных комплексов и вторичности развития в них ПОЛ, к которому пришел Кожевников (1985) после анализа в своём обзоре опубли-кованных работ, представляются логичными.
Конечный эффект при переходе от аноксии к аэробным условиям будет зависим, очевидно, от возникающих гипероксии и пероксидации, т. е. от зна-чений дисбаланса ∆ (ПО – АО). Слишком высокие его уровни должны вести к гибели клеток путём апоптоза А2 или окислительного цитолиза, а промежу-точные между ними и нормой – к апоптозу А1 или спонтанной малигнизации (см. п. 7.1), особенно в режиме периодической аноксии. В последующем факты вовлечения митохондрий к взрывному образованию АФК при реоксигенации показывались неоднократно (Du et al., 1998 и др.). Наглядным свидетельством тому служат, например, данные о заметном снижении степени повреждения печени мыши при реперфузии, если в этом органе перед ишемией одной из его долек суперэкспрессирована митохондриальная Mn-SOD (Zwacka et al., 1998). Логично также, что образование АФК при реперфузии возрастает с увеличе-нием длительности предшествующей аноксии. Это известное положение под-тверждено недавно при реперфузии миокарда крыс после экспериментальной ишемии различной длительности (Городецкая, Каленикова, 2001).
Таким образом, аноксия сама по себе с её способностью повреждать дыха-ние, снижать его интенсивность незначима для спонтанной и вообще для любого другого вида злокачественной трансформации клеток без последующей внутриклеточной гипероксии, ведущей к пероксидации прежде всего липидов и ДНК и к окислительной модификации белков. С этой точки зрения, при непрерывном анаэробиозе спонтанная малигнизация невозможна.
4.2.3. С позиций изложенных в п. 4.2.2 представлений, вопрос о роли «гипоксического ПОЛ» приобретает принципиальное значение для правильного понимания различных патологических процессов, в том числе и механизма спонтанной малигнизации клеток в культуре. Некоторые исследователи для обоснования своей точки зрения прибегают к анализу экспериментальных материалов по ишемии, которые, однако, интерпретируютя не совсем кор-ректно. Их утверждения сводятся к тому, что при ишемии, т. е. в условиях гипоксии, активизируется свободнорадикальное окисление и в ишемизирован-ных органах накапливаются продукты ПОЛ, в частности MDA.
Доказывая ошибочность такого представления, Журавлев (1991) отмечает: «…однако их заключение базируется на определении содержания продуктов свободнорадикального окисления в липидах, экстрагированных из ишемизиро-ванных органов после их оксигенации. Мы предлагаем для расшифровки про-цессов, протекающих при ишемии, липидно-вакуумную хемилюминесцентную модель». С помощью экспериментов в вакууме Журавлев показал, что про-дукты свободнорадикального окисления жирных кислот не накапливаются в вакууме (следовательно, и при ишемии), а образуются из продуктов диссоци-ации при последующем контакте с О2 воздуха после его поступления в систему. При этом происходит резкая вспышка хемилюминесценции, значительно пре-восходящая по интенсивности исходный уровень. Объяснение данного фено-мена автор видит в протекании последовательности процессов:
1. Накопление активных радикальных центров в вакууме (при гипоксии)
ROO → RO˙ + OH˙ ; RH + RO˙ → R˙ + ROH; RH + OH˙ → R˙ + H2O.
2. Развитие хемилюминесцентной реакции при последующем пуске воз-духа (О2)
O2 + R˙ → ROO˙.
Аналогичное в принципе мнение высказано в работе, где рассматривалась роль свободных радикалов О2 в патогенезе повреждения миокарда в постише-мическом периоде. Авторы её (Flaherty, Weisfeld, 1988) представили данные о «взрывном» возрастании уровня свободных радикалов уже в первые 30-60 сек реперфузии, об уменьшении скорости их образования и выраженности пов-реждения миокарда при применении различных антиоксидантов в период реперфузии.
Подробное обоснование тому, почему при гипоксии и последующей реоксигенации происходит усиленное образование АФК, представили также Осипов и соавт. (1990). Опираясь на известные факты того, что в гипокси-ческих клетках повышаются активность NADH-оксидазы, расщепление ATP с образованием ксантина и содержание Fe2+ в свободном и связанном виде, а ксантиндегидрогеназа превращается в ксантиноксидазу, они пришли к заклю-чению: при реперфузии усиливается образование О за счёт окисления NADH NADH-оксидазой и ксантина ксантиноксидазой. Из О образуется Н2О2 и затем в присутствии Fe2+ – радикалы ОН˙, активирующие ПОЛ. Даргел (Dargel, 1992), обобщив обширные сведения о ПОЛ как об одном из основных меха-низмов обратимого и необратимого повреждения клеток и тканей, сделал вывод о важном значении ПОЛ в патогенезе не только атеросклероза, воспаления, раковых заболеваний, но и при повреждении тканей ишемией-реперфузией и ксенобиотиками.
Эксперименты с чередованием ишемии разных органов с их реперфузией проводились и в последующие годы. Например, в опытах на крысах Wistar такая процедура по отношению к печени приводила к накоплению в её ткани соединений, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, и определяемых люми-несцентным методом свободных радикалов (Rhoden et al., 1996). В другой работе после устранения ишемии печени крыс, создававшейся пережатием соответствующих сосудов, увеличивался уровень мРНК гемоксигеназы, кото-рый достигал максимума через 4 ч с момента начала реперфузии, но затем возвращался к норме. Индукцию гемоксигеназы объясняют её протекторной ролью против деструктивных действий окислительного стресса (Ito et al., 1997). Действительно, как уже отмечалось в п. 1.5, гемоксигеназа, будучи стрессор-ным ферментом, защищает сосуды от окислительного повреждения, генерируя из гема вазодилятатор СО и обладающий антиоксидантной активностью билирубин (Deramaudt et al., 1998).
Частым объектом приложения процедур ишемии-реперфузии является и сердце. Анализ патофизиологических процессов при реперфузионных повреж-дениях этого органа проведён в работе (Koike, 1995), в которой, в частности, показаны появление свободных радикалов О2, дисфункция ATPазы, активация фосфолипаз и протеаз – изменения, ведущие к необратимым последствиям в клетках и их гибели. В миокарде крысы после ишемии и последующей репер-фузии сердца снижалась активность SOD, повышалось ПОЛ и возникали значи-тельные нарушения в структуре митохондрий. Введение в/в галлоилгиперина, основного действующего вещества растения Pyrola calliantha, уменьшало все эти сдвиги, что связывается со способностью данного соединения быть ловуш-кой О, образующегося в миокарде при ишемии-реперфузии (Bian et al., 1998).
Достаточно убедительны также результаты опытов на трансгенных мышах, избыточно экспрессирующих Cu,Zn-SOD человека. Исследование повреждений в клетках миокарда, вызванных ишемией-реперфузией показало, что экспрессия SOD в миокарде трансгенных животных, в частности, в миоцитах и клетках эпителия, повышена в 10 раз по сравнению с контролем. Кроме того, методом ЭПР и спиновой ловушки установлен и другой факт: у контрольных мышей через 30 мин глобальной ишемии реперфузия вызывала взрывное образование О, тогда как у SOD-экспрессирующих трансгенных мышей такой взрыв почти отсутствовал, и с этим обстоятельством связывается уменьшение у них разме-ров участков инфаркта миокарда (Wang P. et al., 1998). Обсуждая недавно загадку реперфузии, Скулачев (1999) также поддержал АФК-зависимый меха-низм повреждений клеток при реоксигенации. Основным токсическим агентом является образующийся в реакции Фентона при участии Fe2+ радикал ОН˙. Именно эта реакция и развивается реоксигенацией.
Наконец, в числе экспериментов, подтверждающих изложенные выше пред-ставления, следует отметить следующие. Культуры опухолевых клеток RIF-1 и KHT находились в условиях аноксии (95 % N2 и 5 % CO2) в течение 2,5 ч несколько раз подряд с небольшими перерывами. Затем их пересеивали и определяли колониеобразующую способность. После суммарного 16,5 часового пребывания в указанных условиях и последующего возврата к аэробным клетки KHT и RIF-1 стали обладать более низкой колониеобразующей способностью, причём у первых этот эффект выражен значительнее, чем у вторых. Увеличение суммарного времени пребывания в условиях аноксии до 40 ч приводило к ещё большему снижению колониеобразующей способности, которое особенно выраженным было у клеток KHT (Kiani, Fenton, 1995). И в данном случае угнетающий эффект вызван, очевидно, резко проявляющейся гипероксией пос-ле предварительного выдерживания клеток в бескислородной среде. Не менее доказательны исследования на модели прекращения кровоснабжения опухоли путём пережатия питающего сосуда с последующей реперфузией (Parkins et al., 1996). Здесь показано, что цитотоксичность в опухоли достоверно усилива-ется во время реперфузии. Введение же SOD и каталазы до снятия зажима модулирует цитотоксичность после ишемии-реперфузии, приводя к снижению концентрации свободных радикалов О2, образующихся при реперфузии и окис-лительном «взрыве» в нейтрофилах.
Справедливости ради следует отметить ещё работу, в которой в порядке дискуссии обсуждается альтернативный механизм возникновения гипероксии при реперфузии (Wolbrasht, Fridovich, 1989). Предположительно, гипероксия может быть обусловлена накоплением лактата в ишемизированной ткани и её закислением, что, вследствие эффекта Бора, должно приводить к возрастанию отдачи О2 эритроцитами при реперфузии, увеличению поступления О2 в ткани и активации образования свободных радикалов.
4.2.4. Условия длительного культивирования in vitro неблагоприятны в смысле окислительного стресса для большинства не только нормальных, но и опухолевых клеток. Последние сразу же после выделения их живого организма оказываются в непривычно высокой даже для них, уже гипероксичных, окисли-тельной среде. Эти условия действуют угнетающе на опухолевые клетки. Однако, при культивировании клеток со сниженной опухолегенностью в усло-виях низкого содержания О2 в среде (5 % О2) способность их к формированию новообразований и метастазов восстанавливается (Gordon, DeMarinis, 1990). Витамин Е поддерживает жизнеспособность различных культур злокачествен-ных клеток, а его производные с короткой боковой цепью даже значительно ингибируют рост указанных клеточных культур (Донченко и др., 1998). В другой работе проверялась гипотеза о том, что экспрессия мРНК bFGF, пред-положительно регулирующего ангиогенез, зависит от рО2. С этой целью в атмосфере с 5 % СО2 и варьирующим содержанием О2 (2-50 %) выращивали клетки ретинобластомы человека Y79. При культивировании с 2 % О2 экспрес-сия мРНК указанного фактора была в 40 раз выше, чем при выращивании в присутствии 50 % О2. Подавление экспрессии мРНК bFGF в клетках Y79 при повышенном рО2 явно свидетельствует о регуляции кислородом этого процесса (Higgins et al., 1991). Очевидно, клетки разных типов неоплазм и гетерогенные клетки каждого конкретного новообразования будут отличаться своей чувст-вительностью к кислородно-перекисной перегрузке в условиях in vitro и опре-делять тем самым разную степень своего окислительного повреждения.
Одним из вариантов адаптации неопластических клеток к пероксигеназ-ному стрессу можно считать также результаты, показанные при инкубации лейкозных клеток U-937 в присутствии хлорамфеникола и этидиумбромида. Последние повреждали дыхательные цепи митохондрий, но в этих же условиях наблюдалось повышение Se-зависимой и Se-независимой активности GPX, увеличение содержания мРНК GPX и гемоксигеназы (Bram-billa et al., 1997). Механизм индукции данного эффекта пока не установлен. Однако, как пред-ставляется нам, к его пониманию можно подойти с позиций того, что для рассматриваемых лейкозных клеток изначала характерны недостаточность митохондриального дыхания и соответственно определённая уже степень адап-тации их к состоянию гипероксии и пероксигенации. В этом смысле они имеют «опыт» и «подготовлены» к тому, чтобы при последующем ужесточении такого режима (в данном случае за счёт повреждения дыхательной цепи указанными веществами) усилить в пределах возможного антиоксидантную защиту и, в частности, активизировать экспрессию антиоксидантных ферментов.
Таким образом, гипероксическая среда культивирования, с одной стороны, ответственна за трансформацию адаптирующихся к ней нормальных клеток, но, с другой стороны, продолжает оказывать негативное, токсическое действие и на эти злокачественно трансформированные клетки, изменяя некоторые их свойства, причём не обязательно в сторону усиления злокачественности. Для полной окислительной деградации таких клеток необходим более высокий уровень в них дисбаланса ∆ (ПО – АО).
Наконец, для онкологии, теоретической прежде всего, принципиальными представляются данные о нормализации цитоскелетных структур и морфоло-гии трансформированных клеток in vitro. Как отмечают Бершадский и Ставров-ская (1988), «в ходе опухолевой прогрессии в результате тех или иных воздей-ствий в популяциях малигнизированных клеток могут появляться варианты с нормализованным фенотипом. Нормализация происходит по ряду параметров: прививаемости, росту в полужидкой среде, скорости размножения, морфоло-гии. Механизмы нормализации опухолевых клеток остаются неясными. Ряд наблюдений свидетельствует о том, что ревертанты, полученные в ходе раз-ных процедур отбора, нередко отличаются от исходных клеток увеличением размеров». С целью проверки подобных фактов эти авторы с помощью методов клеточной инженерии увеличили размеры исходных трансформированных кле-ток. При этом оказалось, что такие существенные качественные проявления, как распластывание клеток на субстрате и организация актинового скелета, неизменно возвращаются к близкому к норме состоянию. По итогам исследо-ваний они выдвинули гипотезу: одним из важных механизмов нормализации опухолевых клеток является восстановление их цитоскелета и контактов с субстратом в связи с увеличением размеров и изменением количественных соотношений между компонентами поверхности и цитоплазмы клеток.
Рассматриваемый феномен есть, очевидно, следствие увеличения не просто объёма малигнизированных клеток, но и содержания определённых внутрикле-точных соединений и образований, от функционирования которых прямо или косвенно зависит формирование цитоскелета, контактных и иных структур. Прежде всего, к числу возрастающих по количеству и размерам органелл отно-сятся, по-видимому, всё те же митохондрии. При нормализации цитоскелета (микротрубочек) как транспортной системы, участника организованных локали-зации и движения органелл, в том числе митохондрий (см. п. 2.3.5), и повыше-нии энергетической мощности интенсифицируются потребление О2 и синтез ATP, снижаются внутриклеточное рО2 и уровень ПОЛ. Эти изменения должны положительно отразиться на ATP-зависимом синтезе актиновых филаментов, а в условиях ослабления пероксидации должна возрасти активность адени-латциклазы, сопряжённой в норме с легкоокисляемыми фосфолипидами (см. п. 2.1.9). Вместе с достаточным количеством ATP это неминуемо приведёт к повышению концентрации cAMP и ко многим его эффектам, которые имеют антипролиферативную и противоопухолевую направленность. Среди них такие уже отмечавшиеся нами, как cAMP-стимулируемые фосфорилирование PKA тубулина, необходимое для полимеризации и функционирования микро-трубочек, синтез адгезивных молекул и образующих щелевые контакты белков (см. рис. 16, п. 2.3.4 и 2.4.2).
В обобщённом виде некоторые вышеизложенные положения представлены на рис. 22.
Рис.22. Возможные результаты культивирования нормальных клеток в режиме периодической аноксии




























* * *
Среди других видов канцерогенеза злокачественная трансформация нор-мальных клеток при длительном их культивировании занимает особое место: прооксидантные условия in vitro сами по себе, по-видимому, создают необходи-мую канцерогенную ситуацию. Без всяких дополнительных воздействий извне какими-либо канцерогенными агентами и факторами эти условия способны малигнизировать клетку. Именно поэтому феномен «спонтанной» малигниза-ции рассмотрен в данной монографии, как частный, но наиболее «подготов-ленный» для понимания вариант общей кислородно-перекисной модели кан-церогенеза. Прийти к такому выводу психологически было нелегко из-за всё ещё господствующего мнения о том, что канцерогенез и сопровождающие его процессы и продукты ПОЛ обусловлены гипоксическими условиями, а не гипероксическими. В доказательство этого положения в литературе приводи-лись результаты некоторых экспериментов с культурами нормальных клеток, которые, с нашей точки зрения, интерпретировались недостаточно корректно.
Спонтанной малигнизации должна содействовать способность культур эндотелиальных клеток, гранулоцитов, фибробластов и некоторых других ти-пов клеток продуцировать анион-радикалы О. Образование последних, прямо пропорциональное длительности инкубации и плотности клеточных культур, усиливается при периодическом перемешивании культуральной среды (Murrell et al., 1989). На примере культивируемых фибробластов человека показано, что они сами по себе продуцируют свободные радикалы О2 в концентрации, стиму-лирующей их пролиферацию. «Тушители» свободных радикалов, как и экзоген-ные свободные радикалы, оказывают подавляющее действие на пролиферацию фибробластов (Murrell et al., 1990). Сходный эффект наблюдается в экспери-ментах, где свободные радикалы генерировали, добавляя в культуру фиброблас-тов кожи человека на 3-5-м пассажах гипоксантин и ксантиноксидазу. В малой концентрации (5·10–7 – 10–4 Е/мл) ксантиноксидаза повышала пролиферацию клеток на 20-70 %, а более высокие её концентрации (5 10–3 – 10–2 Е/мл), наоборот, снижали пролиферацию на 60-90 %. Как стимулирующий, так и ингибирующий эффекты ксантиноксидазы подавляются при её тепловой инак-тивации, добавлении в среду ингибитора этого фермента аллопуринола или скавенджеров кислородных радикалов – SOD, каталазы (Murrell et al., 1989).
С нашей точки зрения, приведённые факты чётко отражают проявление in vitro двух противоположных феноменов: в небольшой концентрации «туши-тели» свободных радикалов и другие антиоксидантные факторы могут несколь-ко снижать или, напротив, повышать пролиферацию клеток в зависимости от конкретных уровней образующихся в них органических пероксидов и дисба-ланса ∆ (ПО – АО); слишком же высокие концентрации АФК всегда усиливают пероксигенацию до уровня, вызывающего негативные последствия в клетках и тканях. Эти же мотивы, по существу, проявляются и при спонтанной малиг-низации клеток в условиях культуры, когда отсутствуют даже какие-либо специальные воздействия извне. В гипероксической среде культивирования гетерогенный состав клеток ведёт себя по-разному. Одни из них не выдержи-вают непривычного токсического состояния и подвергаются апоптозу или окис-лительному цитолизу. Другие же постепенно адаптируются к этой ситуации, восстанавливают и даже повышают свой вначале сниженный пролиферативный потенциал и, в конечном итоге, трансформируются в злокачественные клетки согласно кислородно-перекисному механизму. Другими словами, в гетероген-ных клетках культуры могут устанавливаться разные значения дисбаланса ∆ (ПО – АО) из ряда ∆П < ∆А1 < ∆К < ∆А2 < ∆Ц (см. п. 7.1), от которых зависит конкретный индуцируемый из числа указанных кислородно-перекисный про-цесс, в том числе «спонтанная» малигнизация соответствующих клеток.
Отдельные факты нормализации опухолевых клеток в культуре отражают адаптивную их перестройку в ответ на различные процедуры отбора. Основным внутриклеточным фактором, способствующим возникновению ревертантов, постулируется нами нормализация в них энергетических процессов за счёт увеличения количества и размеров митохондрий, снижения «канцерогенезного» дисбаланса ∆К (ПО – АО) до «нестимулированного» ∆Н (ПО – АО) или «про-лиферативного» ∆П (ПО – АО) уровней в норме.
Изложенные представления о спонтанной малигнизации клеток в условиях культуры не являются универсальными, а в отношении некоторых категорий клеток недостаточно реализуемыми. Это касается, прежде всего, эмбриональ-ных и стволовых клеток, в том числе полипотентных кроветворных и клеток-предшественников отдельных ростков кроветворения, ввиду присущих им осо-бенностей (см. п. 2.5). Речь идёт о том, что указанные клетки отличаются малым количеством митохондрий, слабой интенсивностью митохондриального дыхания и соответственно повышенными в них уровнями рО2 и дисбаланса Δ (ПО – АО). В таких относительно оксистрессовых условиях активно проли-ферирующие и дифференцирующиеся эмбриональные и гемопоэтические кле-тки нормально функционируют в режиме чередования окислительного митоге-неза и окислительной дифференцировки. Эта особенность отчасти проявляется, по-видимому, и при культивировании их в гипероксических условиях in vitro. Возможным подтверждением тому служат следующие данные.
В длительных культурах костного мозга мышей, дефицитных по TNF, выявляются некоторые признаки неопластической трансформации: нестабиль-ность генома, гиперплоидия в клетках, увеличение суммарной клеточной попу-ляции, продолжительное поддержание кроветворения и др. Однако при в/б и в/в инъекциях клеток из суспензионной фракции у реципиентов с нормальным и ослабленным иммунитетом не образуются опухоли. С другой стороны, в тех же культурах не происходит блокирования клеточной дифференцировки, и в целом длительное самоподдержание кроветворных предшественников в культуре кос-тного мозга мышей, дефицитых по TNF, не является следствием опухолевой трансформации (Эршлер и др., 2002). Тем не менее, приведённые факты вовсе не означают, что указанные гемопоэтические клетки не трансформировались в лейкозные. Последние известны как просто остановленные в своей дифферен-цировке на стадии клетки-предшественницы (Абелев, 2001) и способны под действием многих агентов и факторов продолжить дифференцировку вплоть до терминальных форм.
В целом же изучение спонтанной малигнизации клеток в процессе их куль-тивирования важно не только с позиций установления единого механизма кан-церогенеза, существование которого не подлежит сомнению. С учётом того, что большинство агентов, индуцирующих опухоли в организме, оказываются спо-собными вызывать трансформации и в культурах, естественно использовать последние для апробирования профилактического и противоопухолевого дей-ствий различных агентов и факторов. В осмыслении получаемых эффектов может быть полезной и изложенная нами концепция «спонтанной» малигни-зации клеток в условиях культуры.



Задать вопрос врачу онлайн
<< | >>
Источник: Б. Н. ЛЮ. СТАРЕНИЕ, ВОЗРАСТНЫЕ ПАТОЛОГИИ И КАНЦЕРОГЕНЕЗ. ЛЕКЦИЯ. 2003

Еще по теме 4.2. Основные положения кислородно-перекисноймодели «спонтанной» малигнизации:

  1. Г л а в а 4«СПОНТАННАЯ» МАЛИГНИЗАЦИЯ КЛЕТОКВ КУЛЬТУРЕ
  2. 4.1. Общая характеристика феномена «спонтанной» малигнизации клеток в культуре
  3. 4.2. Основные положения кислородно-перекисноймодели «спонтанной» малигнизации
  4. Глава 2. Основные положения рационального питания
  5. ВВЕДЕНИЕ В СПЕЦИАЛЬНОСТЬ. ИСТОРИЯ ДИЕТОЛОГИИ. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИЕТОЛОГИИ И ГИГИЕНЫ ПИТАНИЯ.
  6. 1.2.2. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ КОНЦЕПЦИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
  7. 1.2.3. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ВОЕННОЙ ДОКТРИНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
  8. 2.1.1. СУЩНОСТЬ И ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ УПРАВЛЕНИЯ РСЧС И ГО
  9. 4.1.1. СОДЕРЖАНИЕ ОСНОВНЫХ ПОЛОЖЕНИЙ ФЗ «О ЗАЩИТЕ НАСЕЛЕНИЯ И ТЕРРИТОРИЙ ОТ ЧС ПРИРОДНОГО И ТЕХНОГЕННОГО ХАРАКТЕРА»
  10. 8.1.1.2. Основные положения по организации ГО в иностранных государствах
  11. 9.3.1. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ФЕДЕРАЛЬНОГО ЗАКОНА О ЛИЦЕНЗИРОВАНИИ ОТДЕЛЬНЫХ ВИДОВ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ
  12. 9.3.3. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ПОСТАНОВЛЕНИЯ ПРАВИТЕЛЬСТВА РФ № 373 ОТ 31 МАЯ 2002 Г. «О ЛИЦЕНЗИРОВАНИИ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ В ОБЛАСТИ ПОЖАРНОЙ БЕЗОПАСНОСТИ» ПРИКАЗ МЧС РОССИИ № 301 ОТ 20.06.2002 Г.
  13. ПОДРОБНО – Гуманистическая теория личности Э.Фрома: основные положения
  14. Билет 45. Основные положения системного подхода.
  15. Основные положения системного подхода.
- Акушерство и гинекология - Анатомия - Биология - Болезни уха, горла и носа - Валеология - Ветеринария - Внутренние болезни - Восстановительная медицина - Гастроэнтерология и гепатология - Гематология - Геронтология, гериатрия - Гигиена и санэпидконтроль - Дерматология - Диетология - Здравоохранение - Иммунология и аллергология - Интенсивная терапия, анестезиология и реанимация - Инфекционные заболевания - Информационные технологии в медицине - История медицины - Кардиология - Клинические методы диагностики - Кожные и венерические болезни - Лучевая диагностика, лучевая терапия - Маммология - Медицина катастроф - Медицинская паразитология - Медицинская этика - Медицинские приборы - Медицинское право - Наследственные болезни - Неврология и нейрохирургия - Нефрология - Онкология - Организация системы здравоохранения - Оториноларингология - Офтальмология - Патофизиология - Педиатрия - Приборы медицинского назначения - Психиатрия - Психология - Пульмонология - Стоматология - Судебная медицина - Токсикология - Травматология - Фармакология и фармацевтика - Физиология - Фтизиатрия - Хирургия - Эмбриология и гистология - Эпидемиология -