ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №5 Тема: Аплификация образцов выделенной ДНК
Цель занятия: Освоить метод амплификации ДНК
Задачи:
1. Освоить теоретический курс условий проведения амплификации
2. Освоить технику программирования различных видов амплификаторов
3.
Выучить основные технологические приемы подготовки проб к амплификации
Материалы и оборудование для проведения практического занятия.
1. Амплификатор «Терцик» с возможностью программирования и контроля за процессом без использования персонального компьютера. Предназначен для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в клинико-диагностических и научных лабораториях (Рисунок 14).
 |
2. ПЦР бокс БАВ-ПЦР- «Ламинар.-с»
3. Микроцентрифуга-вортекс FV-2400
4. Пипетка-дозатор «Колор» ( 0.5-10 мкл; 5-50 мкл (2 шт); 20-200 мкл; 100-1000 мкл)
5. Реакционная смесь, запечатанная парафином
6. Раствор Taq-полимеразы
7. Минеральное масло
8. Положительный контрольный образец (К+) Положительный контроль позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции. Для этого используют препарат ДНК, содержащий сайты для отжига праймеров: например, ДНК искомого микроорганизма или клонированные специфические участки его генома. Неспецифические ампликоны отличаются по размеру от ампликонов, образуемых в результате амплификации с контрольным препаратом ДНК. Они могут быть как большего, так и меньшего размера по сравнению с положительным контролем. В худшем случае их размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные.
Ход работы:
1. Промаркипуйте пробирки с запечатанной парафином реакционной смесью (с учетом пробирок для положительного контрольного образца- ПК и отрицательного контрольного образца- ОК)
2.
Добавьте в каждую пробирку, не повреждая слой парафина, по 10 мкл тщательно перемешанного раствора Taq-полимеразы3. Добавьте в каждую пробирку по 1 капле минерального масла
4. Перенесите пробирки в зону пробоподготовки
5. Добавьте в каждую пробирку, не повреждая слой парафина, по 0,5 мкл выделенного препарата ДНК (кроме пробирок ОК, ПК). В пробирку маркированную ОК, добавьте 5,0 мкл отрицательного контрольного образца, прошедшего пробоподготовку, в пробирку маркированную ПК, добавьте 5,0 мкл положительного контрольного образца.
6. Центрифугируйте пробирки при 1000 об\мин в течение 3-5 с
| Таблица 2 Режим амплификации 1 | |||||
| Для амплификаторов с активным регулированием | Для амплификаторов без активного регулирования | Количес тво циклов | |||
| Температура | Время | Температура | Время |
| |
| 94°С ' | 1 мин 30 с | 94°С | 1 мин 30 с | 1 | |
| 94°С 64°С 72°С | 20 с 5 с 5 с | 94°С 64°С 72°С | 50 с 50 с 50 с | 5 | |
| 94°С 64°С 72°С | 5 с 5 с 5 с | 94°С 64°С 72°С | 50 с 50 с 50 с | 40 | |
| 10°С | хранение | 10°С | хранение | ||
| Таблица 3 Режим амплификции 2 | |||||
| Для амплификаторов с активным регулированием | Для амплификаторов без активного регулирования | Количес тво циклов | |||
| Температура | Время | Температура | Время |
| |
| 94°С | 1 мин 30 | 94°С | 1 мин 30 с | 1 | |
| 94°С 67°С 72°С | 20 с 5 с 5 с | 94°С 67°С 72°С | 50 с 50 с 50 с | 5 | |
| 94°С 67°С 72°С | 5 с 5 с 5 с | 94°С 67°С 72°С | 50 с 50 с 50 с | 40 | |
| 10°С | хранение | 10°С | хранение | ||
| Таблица 4 Режим амплификации 3
| |||||
| Для амплификаторов с активным регулированием | Для амплификаторов без активного регулирования | Количес тво циклов | |||
| Температура | Время | Температура | Время |
| |
| 94°С | 1 мин 30 | 94°С | 1 мин 30 с | 1 | |
| 94°С 67°С 72°С | 20 с 5с 5 с | 94°С 67°С 72°С | 50 с 50 с 50 с | 5 | |
| 94°С 67°С 72°С | 5 с 5 с 5 с | 94°С 67°С 72°С | 50 с 50 с 50 с | 30 | |
| 10°С | хранение | 10°С | хранение | ||
7.
Установите все пробирки в амплификатор и проведите ПЦР в режиме, проведенном в таблицах, с учетом объема реакционной смеси 35 мкл. Соответствие режимов амплификации комплектам реагентов приведено в таблице 2.Таблица 5 Режим амплификации 4
| Для амплификаторов с активным регулированием | Для амплификаторов без активного регулирования | Количес тво циклов | ||
| Температ ура | Время | Температ ура | Время |
|
| 94°С | 1 мин 30 с | 94°С | 1 мин 30 с | 1 |
| 94°С 62°С 70°С | 20 с 10 с 10 с | 94°С 62°С 70°С | 50 с 50 с 50 с | 5 |
| 94°С 64°С 70°С | 5 с 5 с 5 с | 94°С 64°С 70°С | 50 с 50 с 50 с | 40 |
| 10°С | хранение | 10°С | хранение | |
Положительного контрольного образца (табл.5); в случае отсутствия специфической ДНК в образце (отрицательный образец) дорожка в геле пустая.
Условия хранения
Комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК следует хранить в темном месте при 2-8°С в течение всего срока годности.
Таблица 6 Длина продуктов ПЦР-амплификации
| Продукт ПЦР-амплификации | Длина продукта амплификации , пар нуклеотидов | Длина внутреннего контроля, пар нуклеотидов | |||
| Режим амплификации 1 | |||||
| Хламидия трахоматис (Chlamidia trachomatis) | 415 | 900 | |||
| Микоплазма гениталиум (Mycoplasma genitalium) | 440 | 900 | |||
| Уреаплазма парвум (Ureaplasma parvum) | 383 | 560 | |||
| Уреаплазма уреалитикум (T-960)(Ureaplasma urealyticum) | 206 | 560 | |||
| Трихомонас вагиналис (Trichomonas vaginalis) | 218 | 560 | |||
| Нейссерия гонорреи (Neisseria gonorrhoeae) | 329 | 560 | |||
| Цитомегаловирус (CMV) | 280 | 560 | |||
| Вирус герпеса человека тип б (HHV6) | 277 | 560 | |||
| Вирус герпеса человека тип 8 (HHV8) | 293 | 560 | |||
| Вирус папилломы типы 51, 26 (HPV 51, 26) | 520 | - | |||
| Вирус папилломы типы 6, 11 (HPV 6, 11) | 372 | - | |||
| Бордетелла пертуссис (Bordetella pertussis) | 419 | - | |||
| Легионелла пневмофила (Legionella pneumophyla) | 383 | 560 | |||
| Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori) | 348 | 560 | |||
| Коринебактерия дифтерия (Corynebactehum diphtheriae) - токсигенные штаммы | 251 | 560 | |||
| Стрептококк группы A (Streptococcus pyogenes) | 435 | - | |||
| Токсоплазма гондии (Toxoplasma gondii) | 250 | 560 | |||
| Холерный вибрион (Vibrio cholerae) токсигенные штаммы | 508 | ||||
| Вирус Эпштейна-Барр (EBV) | 185 | 560 | |||
| Вирус варицелла зостер (VZV) | 250 | 560 | |||
| Режим амплификации 2 | |||||
| Микоплазма хоминис (Mycoplasma hominis) | 310 | 900 | |||
| Уреаплазма уреалитикум (Т-960) и Уреаплазма парвум (Ureaplasma urealyticum+Ureaplasma parvum) | 532 | 900 | |||
| Кандида альбиканс (Candida albicans) | 495 | 900 | |||
| Вирус простого герпеса 1,2 (HSV-1,2) | 261 | 900 | |||
| Вирус папилломы тип 16 (HPV16) | 349 | - | |||
| Вирус папилломы тип 18 (HPV18) | 433 | - | |||
| Микобактерия туберкулеза- микобактерия бовис комплекс (М. Tuberculosis - М. Bovis) | 330 | 900 | |||
| Микобактерия туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis) | 263 | ' | |||
| Режим амплификации 3 | |||||
| Гарднерелла вагиналис (Gardnerella vaginalis) | 445 | 900 | |||
| Режим амплификации 4 | |||||
| Вирус папилломы тип 16,31,33,35,35Н, 52,58,67 (HPV16,31,33,35,35H,52,58,67) | 570/642* | ||||
| Вирус папилломы тип 18,45,39,59 (НРУ 18,45,39,59) | 285-297** | " | |||
* - Для комплекта реагентов для ПЦР-амплификации ДНК HPV 16,31,33,35,35Н,52,58,67 при наличии в пробе ДНК HPV 33,58,67 продукт амплификации имеет длину 570 пар нуклеотидов, при наличии ДНК HPV 16,31,35,35Н,52 продукт имеет длину 642 пары нуклеотидов. В положительном контрольном образце ДНК амплифицируются оба продукта. ** - Для амлификационной системы HPV 18,45,39,59 продукты имеют близкие длины (HPV18 - 285, HPV45 - 291, HPV39 - 294, HPV59 - 297 пар нуклеотидов), разница между которыми при детекции не видна.
Контрольные вопросы:
1. Что называется амплификацией в ПЦР анализе?
2. Какие виды амплификаторов АВМ известны?
3. Покажите на амплификаторе «Терцик» работу компьютерного интерфейса и проведите заполнение протокола амплификации Кандиды альбиканс.
4. Какие этапы процесса амплификации вам известны?