ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №7 Тема: Проведение качественного ПЦР-анализа формат «Real-time»
Цель занятия: Освоить метод детекции с помощью детектирующего амплификатора в режиме «Реального времен»
Задачи:
1. Усвоить правило подготовки ДНК образца к детекции в режиме «Реального времен»
2.
Освоить теоретические основы реализации метода детекции с помощью детектирующего амплификатора в режиме «Реального времен»3. Усвоить интерфейс компьютерной программы для реализации программы детекции в режиме «Реального времен»
4. Выучить основные правила безопасного поведения при работе с детектирующим амплификатором в «Реальном времени»
Материалы и оборудование для проведения практического занятия
1. Ламинар типа «ПЦР-бокс»
2. 
Центрифуга (вортекс)
3. Центрифуга Eppendorf Microspin (Рисунок 21)
4. Дозаторы HTL «VE-series»
5. Штатив для дозаторов
6. Штатив рабочее место 200X0,2мл.
7. Штативы для хранения пробирок 100X1,5мл.
8. Детектирующий амплификатор ДТ-322 (Real-time) в комплекте с компьютером
9. Смесь для амплификации, запечатанная парафином
10. Раствор Taq-полимеразы
11. Минеральное масло
12. Положительный контрольный образец (К+)
Ход работы №1
1. Промаркируйте пробирки с запечатанной парафином смесью для амплификации (с учетом пробирок для отрицательного контрольного образца - «К-» и положительного контрольного образца - «К+»).
2. Добавьте в каждую пробирку, не повреждая слой парафина, по 10 мкл тщательно перемешанного раствора Taq-полимеразы.
3. Добавьте в каждую пробирку по 1 капле минерального масла.
4. Перенесите пробирки в зону пробоподготовки.
5. Добавьте в каждую пробирку, не повреждая слой парафина, по 5,0 мкл выделенного из образца препарата ДНК (кроме пробирок «К-», «К+»). В пробирку, маркированную «К-», добавьте 5,0 мкл отрицательного контрольного образца, прошедшего пробоподготовку, в пробирку, маркированную «К+», добавьте 5,0 мкл положительного контрольного образца.
6. Центрифугируйте пробирки при 1000 об/мин в течение 3-5 с.
7. Установите все пробирки в детектирующий амплификатор и проведите ПЦР в режиме, приведенном в таблице 1 или 2, с учетом объема реакционной смеси 35мкл.
Внимание! При работе с комплектом реагентов для выявления ДНК гарднереллы вагиналис (Gardnerella vaginalis) возможно проведение ПЦР в режиме, общем для всех комплектов. В этом случае необходимо обращать внимание на значение порогового цикла Ct (Ср) по FAM: положительными считают образцы для которых значение Q (Ср) по FAM меньше или равно 35.
Ход работы №2
Цель работы: Усвоить интерфейс компьютерной программы для реализации программы детекции в режиме «Реального времен»
Детекция и учет результатов осуществляется на приборах ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология») или iCycler iQ (Bio-Rad) в соответствии с инструкциями к приборам.
ДНК-зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации специфического _продукта и внутреннего контрльного образца, мечены флуоресцентными метками FAM и HEX соответственно.
Примечание: Тест-системы предназначены для детекции результатов ПЦР во время амплификации. В качестве альтернативного способа учета результатов возможно использование метода гель-электрофореза.
Условия хранения
Комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК следует хранить в темном месте при 2-8 °С в течение всего срока годности. Примечание: Допускается хранение пробирок со смесью для амплификации, запечатанной парафином, в темном месте при 18-25 °С в течение всего срока годности.
Таблица 9. Режим амплификации для амплификатора ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК Технология»)
| № блока 1 | Тип блока | Температура | мин | сек | Число повторов | Режим оптических измерений |
|
| цикл | 80 °С | 1 | 00 | 1 | |
|
|
| 94 °С | 1 | 30 |
| |
| 2 | цикл | 94 °С | 0 | 30 | 5 | |
|
|
| 64 °С | 0 | 15 |
| V |
| 3 | цикл | 94 °С | 0 | 10 | 45 (35) | |
|
|
| 64 °С | 0 | 15 |
| V |
| 4 | хранение | 10 |
Данный режим амплификация предназначен для следующих комплектов реагентов:
Хламидия трахоматис (Chlamydia trachomatis), Микоплазма хоминис (M.hominis) Микоплазма гениталиум (M.genitalium) Уреаплазма уреалитикум (Т-960) и уреаплазма парвум (U.urealyticum+ U.parvum) Уреаплазма парвум (U.parvum) Уреаплазма уреалитикум (T-960)(U.urealyticum) Трихомонас вагиналис (Trichomonas vaginalis) Гарднерелла вагиналис (Gardnerella vaginalis) Нейссерия гонореи (Neisseria gonorrhoeae) Кандида альбиканс (Candida albicans) Вирус простого герпеса 1,2 (HSV-1,2) Вирус герпеса человека тип 6 (HHV6) Вирус герпеса человека тип 8 (HHV8) Цитомегаловирус (CMV)
Таблица 10. Режим амплификации для амплификатора iCycler iQ 5 (Bio-Rad).
Для данного режима необходимо активировать переключатель "Use persistent well factor"
| Cycle | Repeats | Step | Dwell time | Setpoint | PCR/Melt Data Acquisition |
| 1 | 1 | ||||
| 1 | 1:00 | 80,0 | |||
| 2 | 1:30 | 94,0 | |||
| 2 | 5 | ||||
| 1 | 0:30 | 94,0 | |||
| 2 | 0:45 | 64,0 | |||
| 3 | 45 | ||||
| 1 | 0:10 | 94,0 | |||
| 2 | 0:45 | 64,0 | Real-time | ||
| 4 | 1 | ||||
| 1 | 1:00 | 10 |
Вирус папилломы тип 16 и 18 (HPV16 и 18) Микобактерия туберкулеза- микобактерия бовис комплекс (М.Tuberculosis - М. Bovis) Бордетелла пертуссис (Bordetella pertussis) Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori) Коринебактерия дифтерия (Corynebacterium diphtheriae) - токсигенные штаммы Стрептококк группы A (Streptococcus pyogenes) Токсоплазма гондии (Toxoplasma gondii) Вирус Эпштейна-Барр (EBV) Легионелла пневмофила (Legionella pneumophila) Вирус варицелла зостер (VZV)