Раздел Vl МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА

B различных разделах настоящего руководства даны рекомендации по приготовлению тотальных препаратов из круглых и плоских червей, их яиц, из насекомых, клещей и других паразитов. Однако изучение только тотальных препаратов, дающих представление о внешнем строении членистоногих и анатомическом строении некоторых червей, далеко не всегда может удовлетворить исследователя.

Гистологическому исследованию обычно подвергаются кусочки тканей или органов с находящимися в них паразитами (например, участок кишки с паразитическими простейшими или гельминтами, кусочки кожи с лейшманиями, кусочки печени с трематодами), либо сами паразитические животные (клещи, комары, плоские или круглые черви), либо отдельные фрагменты этих животных (например, отпрепарированная пищеварительная система клеща, матка аскариды, сколекс лентеца широкого) .

Первый этап гистологического исследования заключается в фиксации исследуемого материала. Поскольку от него часто зависит успех всей дальнейшей работы, очень важно подобрать нужный фиксатор. Последний должен быстро проникатьвткани и клетки исследуемого объекта, в противном случае будут получены искаженные данные о их строении.

B настоящее время в арсенале гистологов имеется большой набор разнообразных (в зависимости от целей исследования) простых и сложных фиксирующих средств.

Ф о p м а л и н — фиксатор широкого профиля. Обычно используется его 10% раствор, однако лучшие результаты дает смесь, приготовленная из следующихкомпонентов: формалина 10% — 10 см3, 10% раствора CaCl (безводного) 10 см3 и дистиллировант ной воды 80 см3. Формалин нужно хранить в темной банке. Для того, чтобы фиксатор имел нейтральную реакцию, на дно ее помещают мел или магнезию.

Минимальное время фиксации — от 24 до 48 ч, хотя материалы можно сохранять в 10% формалине длительное время (лучше в холодильнике). После фиксации материал промывается в проточной воде (12—24 ч). Формалиновая фиксация пригодна для общегистологических целей, а также может использоваться при некоторых гистохимических исследованиях (при выявлении белков, мукополисахаридов и др.).

Ж и д к о с т ь Б у э н а — универсальный фиксатор, готовится перед употреблением из насыщенного водного раствора пикриновой кислоты (15 частей), формалина (5 частей) и уксусной кислоты (1 часть). Материал выдерживают в фиксаторе от 4 до 24 ч или хранят в нем более длительное время, что удобно, например, в экспедиционных условиях. После Фиксации следует промывка в тоех ппрттиях 70° г.пиртя (при этом желтая окраска объекта~может сохраняться!. Фиксация жидкостью Буэна дает хорошие результаты при изучении гистологических структур, но особенно рекомендуется при исследовании соединительной и мышечной тканей.

Ж и д к о с т ь K a p н у а — быстро действующий фиксатор, готовится непосредственно перед употреблением при смешивании 6 частей абсолютного или 96° спирта, 3 частей хлороформа и 1 части ледяной уксусной кислоты. B зависимости от величины объекта фиксация продолжается 0,5—3 ч. После этого объект переносится в 100° или 96° спирт с последующей обработкой его для заливки в парафин. Жидкость Карнуа хорошо фиксирует ядра и применяется при последующем гистохимическом выявлении нуклеиновых кислот.

C м e с ь Ш а у д и н а применяется преимущественно для фиксации простейших, в том числе кишечных, при изготовлении мазков.

Жидкость Ценкера — в наиболееудачной ее модификации — Ценкер-формол по А. А. Максимову, представляет собой сложную смесь, которая готовится в два этапа по следующей прописи:

1) на 100 мл теплой дистиллированной воды добавляют2,5г двухромовокислого калия и 1 г сернистого натрия; эта смесь,

называемая жидкостью Мюллера, хорошо сохраняется и можег быть приготовлена в большом количестве;

2) для приготовления Ценкер-формола перед его употреблением к 100 мл жидкости Мюллера добавляют 5 г сулемы и 10мл формалина. Следует помнить, что погружать в растворы сулемы металлические инструментынельзя. Они должны быть заменены пластмассовыми или же покрыты защитным слоем парафина.

Материал фиксируют в Ценкер-формоле 1—24 ч, чаще 4— 6 ч. После фиксации обязательна длительная промывка в проточной водопроводной воде (24 ч). Для удаления сулемы после промывки материал иодируют, погружая на 30—60 мин в иод- спирт. Эту процедуру можно производить даже не с кусочками фиксированного объекта, а гораздо позже, с готовыми срезами (при этом время йодирования сокращается до 1—2 мин). Иод- спирт постепенно обёсцвечивается от сулемы и периодически должен обновляться. Ценкер-формол хорошо фиксирует тонкие клеточные структуры, ядро и поэтому пригоден для цитологических исследований.

Перечисленные смеси далеко не исчерпывают все известные в гистологической практике фиксирующие вещества, но дают представление об их разнообразии и целях применения. При исследовании какого-либо объекта нельзя ограничиваться применением одной из них. Для разностороннего изучения одноименные объекты фиксируют параллельно несколькими смесями.

Как уже ранее говорилось, фиксатор должен быстро проникать в ткани объекта.

Температура, при которой производится фиксация, также не безразлична для результатов исследований. Чаще всего этот процесс ведется при комнатной температуре. Однако в некоторых случаях можно рекомендовать применение подогретых до 40°, а иногда и до 70° фиксаторов, например жидкость Буэна. И наоборот, часто хорошие результаты получаются при длительной фиксации на холоде, например в 10% формалине в холодильнике в течение не менее 24—48 ч.

Наконец, последнее важное условие работы — это время действия фиксатора. Оно ориентировочно указано в справочниках для каждой смеси, однако более точно устанавливается опытным путем, исходя из особенностей объекта исследования. Оптимальные сроки фиксации должны точно соблюдаться. Недостаточная, а равно слишком длительная фиксация приводит к порче исследуемого материала.

Процесс фиксации плоских паразитических червей (цестод, трематод) часто сопровождается сильным сокращением их кожномускульного мешка. Ha теле червей образуются перетяжки или червь скручивается, и в дальнейшем трудно сделать правильно ориентированные срезы. B последнее время было предложено несколько способов расслабления кожно-мускульного мешка этих червей. Так, рекомендуется обработка их в течение нескольких минут горячей водой, либо раствором 0,1% KOH или 10% этиловым спиртом в течение 15—30 мин. Однако применение этих средств (реллаксов) вряд ли приемлемо при гистологических и гистохимических исследованиях. Скорее всего эти методы годятся при приготовлении из плоских червей тотальных препаратов. ~"’"

^Фиксацию червей для гистологических целей начинают, поместив их между двумя стеклами, но не сдавливая, а затем, по прошествии 10—15 мин, перекладывают объект в бюкс с фиксатором. После фиксации материал нужно тщательно промыть, чтобы полностью удалить фиксатор. Даже небольшие его дозы, оставшиеся в объекте, могут отрицательно повлиять на гистологическую картину. B качестве обычных промывных жидкостей используется водопроводная проточная вода и этиловый спирт. Промывка спиртом производится в бюксах путем 2—3-кратной смены. Количество спирта должно по объему превышать примерно в 10 раз размеры объекта. Для промывки объекта под непрерывной струей водопроводной воды можно использовать самые разнообразные приспособления. Проще всего для этой цели приспособить небольшую стеклянную банку (объемом 50— 100 см3). Горло ее затягивается двойной марлей, и банка ставится под струю воды днем, а на ночь помещается в большой сосуд с водой. Таким образом объект непрерывно промывается водой в течение суток.

FTnr1HP фикгяпии и последующей промывки материал может храниться в течение 1—2 мес. в 70—80° спирте, если возможно. — в холодильнике. Ho лучше сразу же довести материал до парафиновых блоков, так как в этом случае объекты могут храниться без изменения годами^

Членистоногие животные с толстым хитиновым покровом при гистологической обработке должны обязательно подвергаться процессу размягчения хитина.

Полное насыщение происходит через 30 мин и жидкость приобретает желтый цвет.

Если диафанол теряет свой цвет, то он не пригоден. Для сохранения раствор помещают в стеклянную банку с притертой пробкой, смазанной вазелином, и оставляют в темноте. После этого изученный объект подвергаютдействию (15—30 мин) равных частей 5% азотнокислого натрия и 2,5% гипосульфита для удаления диафанола. По окончании процедуры объект вновь промывают в 65° и 96° спиртах.

Предложен ещё один способ размягчения хитина. Материал фиксируют в 10% формалине, приготовленном на 0,8% раствора хлористого натрия, затем переносят сначала в смесь равных частей абсолютного спирта, хлороформа и ледяной уксусной кислоты, в которой растворена до насыщения хлористая ртуть (на 12—24 ч), затем на тот же срок во вторую смесь хлоралгидрата и фенола (1 : 1, получают при нагревании на водяной бане).

У После фиксации каждый объект должен получить соответствующую этикетку, сопровождающую его в течение всей последующей обработки. B этикетке указывается название исследуемого животного (или его органа), дата и название примененного фиксатора. При обработке большого серийного материала следует завести журнал с краткими записями о последовательной гистологической обработке каждого отдельного животного или его части. При ведении журнала каждому парафиновому блоку дается номер, заменяющий более громоздкую этикетку.

Затем следует подготовка материала к заливке в парафин. Перед этим он должен Оыть подностью обезвожен, для чего применяется этиловыи спирт, иоъект последовательно проводят через растворы спиртов восходящей концентрации (40°, 70°, 96°, 100°), которые приготовляют разведением 96° спирта.

При этом берется столько миллилитров спирта исходной крепости, скольких процентов желают получить разведение, и смешивают с таким количеством воды, которое составляет разность между начальной и конечной крепостью спирта. Абсолютный спирт получают также из 96° спирта путем обезвоживания его прокаленным медным купоросом. Химически чистый медный купорос прокаливают в фарфоровой чашке до получения бледно-голубого порошка (не допускать пожелтения!) и засыпают на четверть объема в стеклянную посуду с притертой пробкой. Затем в посуду наливают 96° спирт, встряхивают и дают отстояться. Безводный купорос надо сменить 2—3 раза.

Каждый раз количество спирта должно быть таким, чтобы покрывало объект слоем в 1—2 см. Время нахождения материала в каждой порции спирта зависит от величины объекта. При толщине кусочков 2 мм обезвоживание в одной порции продолжается 2—3 ч (абсолютный спирт дважды меняют).

После обезвоживания материал пропитывается так называемыми промежуточными средами. Они хорошо смешиваются как со спиртом, так и с парафином и поэтому способствуют последующему пропитыванию объекта парафином. Чаще всего при обработке гельминтологического материала с этой целью ис- пользуют хлороформ (безводный). Материал на заключительной стадии ббезвожтгания помещают в смесь ( l : l ) абсолютного спирта и хлороформа на 1,5—2 ч, а затем на такое же время в чйстыи дваЖДы сменяемый хлороформ. Для членистоногих в качестве^промежуточной среды рекомендуют бутиловый спирт. После фиксации объект сначала помещают в 35° этиловый спирт, а потом в разные по соотношению и последовательно сменяемые смеси этилового и бутилового спирта: 1) 9 см3 45° этилового спирта + 1 см3 бутилового; 2) 8 см3 62° этилового спирта + 2 см3 бутилового; 3) 65 см3 77° этилового спирта + + 35 см3 бутилового; 4) 25 см3 90° этилового спирта + 75 см3 бутилового; после чего следует чистый бутиловый спирт.

Хорошей промежуточной средой является метилбензоат. Он удобен в том отношении, что в какой-то степени смешивается с водой и объект может быть помещен в него после 96° спирта. Проще всего в сосуд, где находится объект с 96° спиртом, постепенно подливать метилбензоат, пока объем последнего не превысит объем спирта. После этого объект можно поместить в чистый метилбензоат.

Для Трупнпрежутпихся объектов, (клещей с толстым хитиновым покровом или червей с маткой, заполненной яйцами) прибегают к комбинированному методу обработки объекта. с применением целлоидина. Метод заключается в том, что после обезвоживания материал из 100° спирта переносят либо в целлоидиновое масло (к 100 см3 2% целлоидина в смеси 1 : 1 абсолютного спирта и серного эфира прибавляют столько же касторового масла), либо в 1% раствор сухого целлоидина в метилбензоате (растворение идет в течение нескольких недель), либо в смесь Петерфи (смесь равных количеств 2% целлоидина (см. выше) и гвоздичного масла). B этих смесях объект выдерживают в течение суток, но он может находиться в ней несколько дней, а при необходимости — недель и даже месяцев. Затем следует обработка материала хлороформом (после целлоидинового масла или смеси Петерфи) или бензолом (после целлоидинбензоата) в течение 1—3 ч. Доведенный до хлороформа (или бензола) материал подготовлен к последнему этапу обработки — пропитыванию парафином и заливке в блоки.

Пропитывание материала парафином осуществляется в двух термостатах, отрегулированных на 37" и bb". При 'ÒT нагревают смесь равных частей парафина и хлороформа (или бензола) в бюксе с хорошо притертой крышкой. B этой смеси объект выдерживают от 2 до 12 ч (можно и удобно оставить на ночь). После этого объект пропитывают в течение 30 мин — 1 ч в каждой из двух порций чистого парафина в термостате при 56°. Парафин следует держать в открытых (для испарения хлороформа или бензола) баночках или маленьких кристаллизаторах, обязательно пронумерованных (№ 1 и № 2), так как они используются неоднократно и в первой банке могут быть примеси хлороформа. Баночки с парафином должны быть заранее нагреты в термостате. Для перенесения объекта из одного парафина в следующий баночки вынимаются из термостата и объект быстро переносится из одной в другую нагретым шпателем или пинцетом.

Для окончательной заливки материала используется чистый парафин (лучше его хранить в небольшой колбеІ, Для того, чтобы получить хорошо режущийся «заливочный» парафин, его нужно приготовить по следующему рецепту: 85 г парафина с точкой плавления 60° расплавляют, добавляют в него 10 г стеарина и 5 г белого пчелиного воска. Всю расплавленную массу выливают в таз с холодной водой, слегда остужают, потом собирают в комок и мнут руками. Снова расплавляют и снова выливают в таз с водой и т. д., повторяя эту процедуру 2—3 раза. Такой парафин хорошо режется на микротоме и дает возможность делать тонкие срезы. Готовый к употреблению «заливочный» парафин расплавляют и наливают в приготовленные формы. Мелкие объекты заливаются в часовых стеклах. Более крупные удобнее заливать, используя пару металлических угольников. Последние ставятся на стеклянную пластину на таком расстоянии, которое соответствует размерам заливаемого объекта (рис. 119). Bce поверхности заливочной формы, соприкасающиеся с парафином, слегка смазывают чистым глицерином, чтобы в дальнейшем парафиновый блок легко отделялся от формы. Применяют для заливки и бумажные формы. Их делают каждый раз в соответствии с размерами и количеством заливаемых кусочков; они удобны для карандашного обозначения номера блока (рис. 119, Б). После того, как форма заполнена расплавленным парафином, в нее быстро нагретым пинцетом переносят объект и нагретыми препаровальными иглами располагают наиболее удобным образом. Парафин следует возможно быстрее охладить. Для этого заливочную форму с материалом переносят в кристаллизатор с холодной водой. Как только на поверхности парафина появится твердая

Рис. 119. Заливочные формы для приготовления парафиновых блоков (по Г. И. Роскину, 1957).

Л — металлические угольники на стеклянной подставке; Б(1—3)— схема изготовления бумажной формы.

пленка (ее образование можно ускорить, подув на поверхность парафина), форму погружают в воду и оставляют до полного остывания блока. Залитый в парафин материал может долго храниться, не теряя своих структурных особенностей.

дальнейшая обработка материала, я именно наклейка парафиновых блоков на деревянные колодки, техника резки их на микротоме в отношенини паразитологических объектов, ни- чем~не отличается от обычных методик. Поэтому мы рекомен

дуем ознакомиться с этой частью гистологической техники по многочисленным руководствам, где эти вопросы изложены достаточно подробно и понятно. Заметим лишь, что обычный санный микротом дает возможность получать срезы от 3 до 15 мкм толщиной. Если исследование проводится с целью установить топографию отдельных органов, то вполне можно ограничиться

C X e м а

Обработка материалов для гистологических исследований

толстыми срезами (10—15 мкм). Для тонких гистологических и цитологических исследований нужны срезы не более 5 мкм толщиной.

Вся обработка материала, начиная от момента фиксации и кончая заливкой в парафин, может быть выражена в виде схемы.

Окраска срезов. Стекла со срезами могут непродолжительное время (1—2 недели) храниться в закрытых от пыли папках. Сопроводительную этикетку кладут под первое стекло. Если из целого животного (или отдельного его органа) делают серийные срезы, которые последовательно располагают на многих стеклах, то последние нумеруют с помощью алмаза. B зависимости от целей исследования заранее подбирают красители и приступают сначала к депарафинизации, а затем к окрашиванию срезов.

Техника окоаски заключается в следуюшем: а) стекла со срезами помещают последовательно в две порции ксилола для растворения парафина, б) проводят через спирты 96° и 70° для отмывки ксилола и частичного насыщения водой, в) кладут на

5— 10 мин в дистиллированную воду г) окрашивают, д) обезвоживают в спиртах 70°, 96° и карбоксилоле (или абсолютном спирте), e) просветляют в ксилоле, ж) заключают в бальзам (диаммарлак или другие среды). Бальзам (или другую среду для заключения) готовят из кусочков смолы (пихтовой, дам- маровой), растворяемых в ксилоле. Для заключения срезов приготовляют более жидкий бальзам, чем для тотальных препаратов. Свежеприготовленные препараты должны находиться в горизонтальном положении на планшетах для испарения ксилола и затвердевания бальзама. После этого стекла со срезами нумеруют и надписывают специальными чернилами по стеклу или черной тушью.

Высохшую надпись тушью покрывают сверху тонким слоем бальзама или жидкого органического стекла (растворяют несколько кусочков плексиглаза в хлороформе).

B гистологической практике имеется много красителей и методов окрашивания. Ниже приводятся наиболее часто применяемые методы окраски срезов.

O к p а с к а к в а с ц о в ы м г e м а т о к с и л и н о м — э о з и- н о м представляет распространенный и довольно простой способ двойной окраски срезов: из дистиллированной воды срезы помещают в раствор квасцового гематоксилина и окрашивают в течение 1—5 мин, 5—20 мин промывают проточной водой, до посинения срезов; споласкивают дистиллированной водой, окрашивают 0,1% водным эозином в течение 5—10 мин, ополаскивают дистиллированной водой. B результате ядра элективно окрашиваются в синий цвет, а цитоплазма — в розово-красный. Хорошо окрашенный препарат имеет много оттенков красного цвета. Различные типы тканей окрашиваются дифференцированно. Для приготовления квасцовых гематоксилинов пользуются рецептами Карачии, Бемера, Делафильда.

Bce манипуляции по окраске срезов на предметных стеклах производятся в специальных биологических стаканчиках. Набор их в количестве 8—10 штук помещается в гнездах деревянной колодки.

0 к p а с к a ж e л e з н ы м г e м а т о к с и л и н о м п о м e- тоду Г айденгайна незаменима в тех случаях, когда выявляются тончайшие детали строения ядра (в том числе находящегося в стадии митотического деления) и цитоплазмы. Лучшие результаты получаются после сулемовых фиксаторов (Ценкер- формол, фиксатор Шаудина и др.). Окраска этим методом пригодна для тонких парафиновых срезов (не более 5 мкм) и для мазков с кишечными простейшими(см. соответствующий раздел книги). Методика окрашивания сложнее, чем предыдущая, и заключается в следующем: срезы (или мазки) из воды помещают в 2,5% раствор железоаммиачных квасцов, где они протравливаются в течение 1—12 ч, после тщательного трехкратного ополаскивания в воде их окрашивают красителем (0,5 г гематоксилина+10 мл 96° спирта, после растворения +90 мл дистиллированной воды).

Гематоксилин созревает около месяца, но можно пользоваться и свежим красителем, который дает голубовато-синее окрашивание. Старые растворы гематоксилина, дающие рыжеватый оттенок, не пригодны для употребления. Окрашивание длится от одного до нескольких часов (в термостате быстрее); при этом срезы становятся интенсивно черными. Для дифферен- цировки (удаления избытка красителя) срезы помещают в 1 % раствор железоаммиачных квасцов. B процессе дифференци- ровки срезы отдают избыточную окраску и заметно для глаза светлеют. Время от времени необходимо этот процесс контролировать под микроскопом. Для этого стекло со срезами удобно поместить в чашку Петри с раствором железоаммиачных квасцов. Отдифференцированные срезы помещают на 15—20 мин в проточную водопроводную воду. Иногда пользуются более быстрым способом окраски, предложенным Гурвичем. Последовательность обработки срезов остается при этом той же, но все реактивы (протрава и краситель) наливаются на стекло со срезами, которое осторожно нагревается над пламенем спиртовки до появления паров. Повторно употреблять реактивы при этом способе нельзя.

Окраска гематоксилином с пикроиндигокар- мином по Кацнельсону. Из простых и многокрасочных методов окрашивания следует упомянуть метод окраски любым квасцовым гематоксилином с докраской пикроиндигокармином. Доведенный до воды срез перекрашивают гематоксилином Ka- рачии (или Делафильда, или другим гематоксилином), промывают водой и 5—10 мин красят пикроиндигокармином (0,5 г индигокармина растворяют в 150 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты), наливая краситель на стекло. Затем срезы ополаскивают водой и быстро обезвоживают. B результате ядра приобретают коричневый цвет, цитоплазма — зеленый, Сбединительная ткань и мышцы — разные оттенки желтого и зеленого цветов.

Aз а н о в ы й м ето д_ о_кр а ш и в а н и я п о Г а й д e н - г а й н у. При изучении многоклеточных животных с различными типами тканей лучшие результаты дает применение сложных методов окрашивания. При этом достигается отчетливая диф- ференцировка тканей и препарат получается четким и удобным для изучения.

Из этих методов окрашивания чаще всего применяется аза- новый, состоящий в следующем. Из воды срезы переносят в краситель азокармин (1% водный раствор, на 100 мл которого прибавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты) и окрашивают в течение 1 ч в термостате при 50—60°, или 3 ч при комнатной температуре. После этого препарат споласкивают водой и дифференцируют в спиртовом растворе анилина (1 мл анилина на 1000 мл 90° спирта) до четкого выявления ядер (контроль под микроскопом!), затем отмывают анилин вуксусно-кислом спирте (1 мл ледяной уксусной кислоты на 100 мл 96° спирта), протравливают срезы в 5% растворе фосфорно-вольфрамовой кислоты (накапывая ее на стекло) в течение 30 мин и споласкивают водой. Сразу же вслед за этим препарат помещаютвсмесь Маллори, состоящую из анилинового синего (0,5 г), оранж (2 г), дистиллированной воды (100 мл) и ледяной уксусной кислоты (8 мл). Смесь кипятят и фильтруют, хранится она долго и может быть употреблена многократно. B заключение срезы ополаскивают водой, дифференцируют в 90° спирте (5 мин) и заключают в бальзам. Ядра окрашиваются в красный цвет, соединительная ткань — в синий, мышцы — в красный или фиолетовый, слизь — в синий цвет.

Азановый метод особенно хорош при окраске срезов плоских червеи, имеющих паренхиму. Олїїдует отметить, что наилучшие " результаты азановое окрашивание дает после биксации материала в ценкер-формоле или в жидкости БуэнаУ

Кроме вышеописанных методов окрашивания срезов, имеющих широкое и разнообразное применение в гистологической технике, разработаны специальные гистохимические методы, применяемые для выявления химического состава клеток. Так можно обнаружить наличие мукополисахаридов, белков, жиров, нуклеиновых кислот и т. д. Эти методы более сложные, требуют большего навыка в работе, а также специальной подготовки исследуемого материала.

B итоге окрашенные и заключенные в бальзам срезы изучают под микроскопом при разных увеличениях. Для просмотра препарата со многими срезами пользуются крестообразным столиком или препаратоводителем. C их помощью препараты можно передвигать в продольном и поперечном направлениях и определять координаты мест, интересующих исследователя. Некоторые исследователи для маркировки нужных им срезов пользуются бблСе простым способом, а именно отмечают их тушью (кружочком, крестиком, точкой). Эту метку сначала

можно ставить на покровном стекле, но затем ее лучше перевести на нижнюю сторону предметного стекла, где она дольше сохранится.

При морфологических исследованиях часто возникает необходимость сделать с препаратов рисунки, для чего нужно пользоваться рисовальным аппартом. Рисование срезов является весьма важным методом изучения материала. Если организация животного изучается по серии срезов, то каждый срез (или каждый второй — третий срез) зарисовывается на отдельном листе бумаги. Зарисовывают контуры среза и схематично изображают цветными карандашами контуры внутренних органов. Затем листы с рисунками склеиваются гармошкой, при разворачивании ее получается целостное представление об анатомии изучаемого объекта. B зависимости от целей исследования таким методом можно изучить схему общего анатомического строения или какой-либо системы органов животного.

Помимо построения такой грубой схемы прибегают к более тонкому и точному, но чрезвычайно кропотливому и длительному способу — реконструкции по срезам. Подробное описание пластической и графической реконструкции имеется в первом томе Большого практикума по зоологии беспозвоночных. Кроме анатомических рисунков, приходится делать гистологические. Ha них фиксируются детали тонкого микроскопического строения тканей и клеток. Различают рабочие или черновые рисунки, которые делаются в процессе обработки материала, и чистовые рисунки, представляющие собой обобщения, полученные на основании изучения срезов и черновых рисунков. Последние делаются карандашом, чистовые рисунки выполняются тушью и служат в дальнейшем как иллюстрации к научной работе.

Однако рисунки представляют собой лишь схему изучаемого объекта. B последнее время для научной документации работы прибегают к микрофотографированию. B этой работе необходимо приобретение большого опыта для получения хороших снимков. Затруднительно дать какие-либо краткие и общие советы, так как многое зависит от наличия технических средств. Полезные сведения по данному вопросу можно почерпнуть в книге Л. А. Федина и И. Я- Барского (1971), специально посвященной вопросам фотографирования. Нужно отметить, что при микрофотографировании рационально делать сразу два рода снимков: на негативную пленку для получения фотографий и позитивную для получения диапозитивов (слайдов).

Кроме работы с обычным световым микроскопом, применяют такие методы микроскопических исследований, как флюоресцентная микроскопия и фазово-контрастный метод. При фазовоконтрастном методе можно использовать обычный микроскоп МБИ с панкратическим конденсатором и фазово-контрастным приспособлением. Оно состоит из специальных объектов и вспомогательного микроскопа малого увеличения. Применение этого

метода микроекопирований делает чрезвычайно контрастным изображение неокрашенных клеток и тканей. Поэтому фазовоконтрастная микроскопия незаменима при наблюдении живых объектов — микробов, культуры тканей, простейших организмов, в том числе кишечных простейших и их цист.

Дальнейшее развитие микроскопической техники связано с созданием и совершенствованием электронного микроскопа, дающего огромные (более чем 150 000 раз) увеличения и тем Самым позволяющего изучать субмикроскопические структуры тканей и клеток.

Техника обработки материала для электронной микроскопии в целом сходна с обычной гистологической, однако здесь применяют набор специальных фиксаторов. Тотальные препараты готовят из бактерий, вирусов, более крупные объекты подвергают заливке в затвердевающие смолы и затем разлагают на тончайшие срезы (20—30 нм) на ультрамикротоме. Окрашенные (контрастированные) срезы просматривают с помощью электронного микроскопа и нужные места фотографируют. B дальнейшем изучаются полученные фотографии, так как срезы долго не сохраняются. Наиболее полноценные данные получают при параллельном изучении объекта в световом и электронном микроскопах.

B последние годы сконструирован сканирующий микроскоп, с помощью которого стало возможно изучать ультратонкие детали поверхности тела организмов. Особую ценность подобные исследования приобретают в применении к сенсорным аппаратам членистоногих, в изучении структуры хитинового покрова клещей и т. д.

B заключение необходимо заметить, что приведенные здесь сведения рассчитаны на то, чтобы правильно ориентировать читателя в отношении последовательности и объема работ при микроскопических исследованиях. Как уже неоднократно подчеркивалось выше, рекомендованные методики не исчерпывают все известные варианты гистологических работ и потому заинтересованному лицу необходимо ознакомиться с основными работами по данному вопросу — А. В. Немилова 1923; А. В. Иванова и др., 1941, 1946; Ромейса 1955; P. И. Роскина, 1954, Л. С. Гольдина, 1963, идр.