Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 2002-2006 г на базе отдела контроля качества и стандартизации лекарственных средств против микозов и микотоксикозов животных ФГУ ВГНКИ, а также Ветеринарном Центре ФГОУ ВПО МГАВ- МиБ и др.

2.1.1. Животные. При выполнении работы было использовано 227 собак и 17 кошек различных пород и возрастных групп, принадлежавших питомни­кам и частным лицам. Были сформированы три группы животных: животные

с клиническими проявлениями отита, животные с клиническим проявления­ми дерматита, клинически здоровые животные. При изучении вирулентности культур грибов для экспериментального заражения использовано 175 ин­тактных белых мышей в возрасте 5-6 недель средней массой 13-14 грамм, выращенных в питомнике ОПХ «Манихино».

2.1.2. Культуры микроорганизмов. Для изучения биологических свойств было использовано 32 эпизоотических штамма грибов вида М. pachydermatis, выделенных от животных:

Malassezia pachydermatis 10603 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 11503 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 11903 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 12003 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 12403 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 12803 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 12903 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 13003 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 13203 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 13303ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 13403 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 13703 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 13903 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 14003 ВГНКИ - выделен в 2003 г.

М. pachydermatis 14203 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 14303ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 14503ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 15003ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 15103/1 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 15103/2 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

M. pachydermatis 15503ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 16103 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 16903ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 17803 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 17903 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 18003 ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 18403ВГНКИ - выделен в 2003 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 20004ВГНКИ - выделен в 2004 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 20504ВГНКИ - выделен в 2004 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 20904ВГНКИ - выделен в 2004 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 21004ВГНКИ - выделен в 2004 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

М. pachydermatis 21604 ВГНКИ выделен в 2004 г. в ФГУ «ВГНКИ»;

2.1.3. Питательные среды. Для выделения и изучения биологических свойств грибов рода Malassezia использовали среды: Сусло-агар; Чапека; Барфатини [4]; Диксона модифицированная [56]; ПД-2. ООО «Биомед».

В ряде случаев в питательные среды добавляли селективные антибакте­риальные добавки (хлорамфеннкол, Oxoid).

2.1.4. Сбор анамнеза и описание клинической картины кожной формы болезни животных.

В исследование включались собаки и кошки различных пород, содер­жавшиеся как у частных владельцев, так и в питомниках.

При включении животного в исследование учитывались следующие данные: вид животного, порода, пол, возраст, условия содержания, состав рациона, наличие в анамнезе инфекционных и незаразных патологий, при­менение химиотерапевтических, гормональных и других лекарственных пре­паратов, вакцинация против инфекционных заболеваний.

низации, мацерации кожи, образование и характер экссудата, нарушения пигментации кожи, наличие зуда, расчесов, самотравмирования, запах пора­женных участков, признаки беспокойства животного. При отитах также учи­тывали: локализацию (односторонний или двухсторонний отит), характер и количество ушного секрета, наличие стеноза ушного канала. Были сформи­рованы три группы животных: 1. Животные с клиническими проявлениями отита (otitis externa); 2. Животные с клиническим проявлениями дерматита; 3. Клинически здоровые животные без признаков отитов и дерматитов (кон­трольная группа, использованная для сравнительного изучения численности популяции дрожжевых грибов). Животные опытных групп включались в ис­следование при условии отсутствия применения местных и общих лекарст­венных препаратов в течение как минимум 2 недель до начала исследования.

2.1.5. Методы отбора патологического материала. 1. Метод контактных чашек (бакпечаток). Пластиковые чашки диаметром 4 см. (изготовитель «Медполимер»), заполненные до краев плотной питательной средой, прикла­дывали на 10 сек. к пораженному участку кожи. После этого чашки закрыва­ли крышкой и инкубировали в соответствующих условиях. 2. Метод с ис­пользованием липкой ленты (скотча). Полоску прозрачного скотча площадью 2x2 см прикладывали липкой стороной к очагу поражения и затем сразу по­мещали на предметное стекло для дальнейшего цитологического исследова­ния. 3. Метод с использованием ватного тампона-зонда. Использовали сте­рильные ватные тампоны-зонды в стерильных пробирках (коллекторах), вы­пускаемые промышленным способом. При отборе патматериала от животных с клиническими признаками отита тампон-зонд через стерильный металличе­ский тубус вводили в слуховой проход и проворачивали вокруг оси на 360°, после чего помещали в стерильную пробирку.

тампон-зонд на пластиковом стержне в пробирке с транспортной средой Эймса производства Eurotubo (Испания). Техника отбора была аналогична таковой при использовании ватного тампона-зонда. 5. Метод соскоба. Мате­риал из кожных поражений (корочки, чешуйки) отделяли скальпелем в сте­рильную чашку Петри. Волосы отбирали пинцетом с периферии очагов по­ражения. 6. Метод смыва. К подготовленному (выстриженному и при необ­ходимости выбритому) участку кожи плотно прикладывали стерильный ме­таллический цилиндр с внутренним диаметром 3 см. Затем на участок кожи, ограниченный цилиндром, наносили детергент (физиологический раствор) в объеме 3 см³, затем детергент отсасывали пипеткой в стерильную пробирку и использовали для дальнейшего лабораторного анализа.

2.1.6. Микроскопическое исследование патологического материала. Микроскопическое исследование проводили как в нативных, так и в окра­шенных препаратах. Для мацерации плотного материала (волосы, корочки) готовили препараты в 10% КОН, подогревали над пламенем горелки, не до­водя до кипения, после чего накрывали покровным стеклом и микроскопиро- вали. Микроскопию проводили на световом микроскопе Micros (Австрия) при увеличении х40, хЮО, х200, х400.

Для приготовления окрашенных препаратов на обезжиренном предмет­ном стекле ватным тампоном с патматериалом делали 1 штрих, после чего препарат высушивали и фиксировали над пламенем горелки. После этого препарат окрашивали одним из следующих красителей: 1. Лактофенол синий 2. Лактофуксин 3. Метиленовая синь.

Окрашенный препарат накрывали покровным стеклом и исследовали в световом микроскопе сначала при малом увеличении (х100), затем при боль­шом (х400). При обнаружении окрашенных дрожжевых клеток описывали их морфологию и проводили их количественный учет в 10 полях зрения микро­скопа при увеличении х400.

2.1.7.

При посеве на питательные среды в чашках Петри ватным тампоном с патологическим материалом делали 6 штрихов по поверхности питательной среды. Каждым образцом засевали 3-5 чашек. Засеянные чашки помещали в термостат при температуре 36°С. Одновременно делали контрольные посевы воздуха в боксе на те же питательные среды.

Посевы инкубировали в течение 5-10 сут., просматривая через каждые 2- 3 сут. По окончании культивирования проводили видовую идентификацию выросших культур дрожжевых грибов и их количественный учет. Культуры, полученные одновременно в опытных и контрольных чашках, не учитывали.

2.1.8. Видовая идентификация грибов рода Malassezia. Видовую иденти­фикацию проводили на основании изучения морфологических и физиологи­ческих свойств выделенной культуры. При изучении колоний учитывали форму, цвет, рельеф, характер поверхности, консистенцию, форму краев, размер колонии. Для микроскопического исследования готовили препараты из культур грибов типа «раздавленная капля» [6]. При микроскопическом ис­следовании определяли тип почкования клеток, их форму, соотношение раз­меров материнской и дочерней клеток, наличие гиф. Размер клеток опреде­ляли окуляр-микрометром (Micros). В качестве основного физиологического критерия для идентификации использовали способность культуры к росту на среде без добавления липидов (среда Сабуро, сусло-агар). При необходимо­сти дополнительно проводили изучение ферментативной и ассимилятивной активности культур грибов (см. ниже), способности к росту при 40°С. По

указанным свойствам проводили видовую идентификацию культуры в соот­ветствии с определителем «Atlas of clinical fungi» [23].

2.1.9. Изучение ферментативных свойств грибов рода Malassezia.

Уреазную активность изучали при посеве культур на среду Кристенсена

с мочевиной (производства HiMedia, Индия). Посевы инкубировали при 36°С в течение 7 сут. При наличии уреазной активности среда приобретала ярко­малиновую окраску.

Ферментацию цитрата изучали при посеве на цитратную среду Кристен­сена (производства АООТ Биомед). Посевы инкубировали при 36°С в тече­ние 7 сут. При наличии уреазной активности среда приобретала ярко­малиновую окраску.

Каталазную активность определяли, смешивая на предметном стекле с лункой каплю грибной взвеси и каплю пероксида водорода (3% раствор, производство «ЭКОлаб»). При наличии каталазной активности наблюдали газообразование в реакционной смеси по В. Tarazooie [163].

2.1.10. Изучение ассимилятивных свойств грибов рода Malassezia по М. Crespo [58].

Ассимиляцию источников липидов изучали при посеве культур на среду для изучения ассимиляционных свойств дрожжевых грибов (Yeast nitrogen base, Himedia, Индия). В агаровой пластине застывшей среды делали лунки диаметром 1 см, куда вносили соответствующие субстраты в объеме 0,3 см³ - Твин-40, Твин-80 (производства Merk, Германия). По окончании культивиро­вания отмечали наличие роста грибных колоний вокруг лунок, что свиде­тельствовало о способности изучаемой культуры гриба ассимилировать соот­ветствующее вещество.

2.1.11. Определение концентрации клеток в суспензиях культур грибов проводили путем подсчета грибных клеток в счетной камере Горяева [3].

2.1.12. Определение жизнеспособности грибных клеток. Готовили се­рийные разведения суспензии культур грибов в физиологическом растворе

l:10^-1, l:10’², 1:10’³... и т.д. в зависимости от концентрации грибных клеток. Затем делали высев суспензии культуры на питательные среды в чашках Петри в объеме 0,5 см³. Для посева брали по 4 пары чашек. После культиви­рования проводили количественный учет выросших грибных колоний. Жиз­неспособность грибных клеток определяли по формуле:

C=(K/V₀)x, где К - степень разведения, V_o- объем посевной дозы, х — среднее арифметическое сумм колоний, выросших на парных чашках.

2.1.13. Изучение вирулентных свойств грибов рода Malassezia.

Определение LD50 культур грибов.

Культуры для заражения выращивали в пробирках на среде Барфатини при 37°С в течение 7 сут. По окончании культивирования готовили суспен­зии дрожжевых клеток в физиологическом растворе. Концентрацию дрожже­вых клеток в полученных суспензиях определяли подсчетом в камере Горяе- ва. Из исходной суспензии каждого штамма готовили ряд разведений с кон­центрацией дрожжевых клеток 200 млн/см³, 500 млн/см³, 1 млрд/см³, 2 млрд/см³, 3 млрд/см³, 4 млрд/см³. Полученные разведения вводили животным внутрибрюшинно, в объеме 0,5 см³. Животным контрольной группы в каче­стве плацебо внутрибрюшинно вводили физиологический раствор.

При проведении опыта были соблюдены стандартные условия содержа­ния, кормления и ухода для всех групп мышей.

Клинические наблюдения за животными проводились ежедневно, при этом фиксировали клиническое состояние и наличие падежа. Павшие мыши подвергались патологоанатомическому и микологическому исследованию. Для микологического исследования отбирали патматериал из кожных пора­жений, паренхиматозных органов, лимфоузлов и кишечника. Микологиче­ский анализ включал микроскопию патматериала и его посев на питательные среды: модифицированный агар Диксона, среду Барфатини с хлорамфенико- лом (OXOID), сусло-агар, сусло-агар с селективной добавкой Dermasel (цик­логексимид и хлорамфеникол) (OXOID). Культивирование проводилось при

температуре 37°С в течении 7-10 сут. При выделении из патматериала куль­туры гриба проводили ее идентификацию и сравнение с исходной культурой, использованной для заражения. Срок наблюдения за подопытными живот­ными составил 25 сут.

По окончании опыта для оценки вирулентности культур грибов вычис­ляли показатель LD₅₀ по методу Кербера в модификации Ашмарина (Мето­дическое руководство по лабораторной оценке качества бактерийных и ви­русных препаратов. М., Гос. Контрольный институт медицинских биологиче­ских препаратов им. Л.А. Тарасевича, 1972).

Определение вирулентности культур грибов методом накожного зара­жения проводили на беспородных собаках в возрасте 1-3 года, на момент проведения эксперимента клинически здоровых. Между лопатками выстри­гали и выбривали участок кожи площадью 5x5 см, обрабатывали 96° этано­лом, скарифицировали скальпелем до появления гиперемии, не допуская травмирования кожного покрова. Взвеси грибных культур в физиологиче­ском растворе наносили пипеткой на подготовленные участки кожи, втирали шпателем. Животным контрольной группы в качестве плацебо наносили фи­зиологический раствор. Наблюдения за животными проводились ежедневно, включали общий клинический осмотр, оценку клинических изменений в оча­гах заражения, отбор патологического материала из очагов заражения для последующего микологического исследования. Наблюдения за животными продолжались вплоть до исчезновения клинических признаков.

2.1.14. Определение чувствительности культур грибов к антифунгаль­ным препаратам. Определение чувствительности культур грибов к антифун­гальным препаратам проводили диско-диффузионным методом. Использова­ли диски, импрегнированные антифунгальными препаратами производства HiMedia (Индия): амфотерицин-В (100 U/диск), нистатин (100 U/диск), клот- римазол (10 мкг/диск), флуконазол (10 мкг/диск), кетоконазол (10 мкг/диск).

Для посева на определение чувствительности готовили взвеси культур грибов в физиологическом растворе с содержанием 500x10⁶ клеток в 1 см³ по оптическому стандарту мутности (без пересчета на размер клетки гриба). По­сев осуществляли на питательные среды в чашках Петри в объеме 2-3 см³, и покачиванием равномерно распределяли взвесь по всей поверхности пита­тельной среды. Избыток взвеси сливали. Чашки выдерживали при комнатной температуре около 40 мин. После этого импрегнированные диски помещали в чашки Петри с помощью диспенсера на равном расстоянии друг от друга. Посевы инкубировали при 36°С, учет результатов проводили на 7-е сутки выращивания, измеряя диаметр зоны подавления роста (ЗПР) культуры во­круг диска. Результаты измерения интерпретировали согласно соответст­вующей таблице, прилагавшейся производителем к набору дисков: амфоте- рицин В: диаметр ЗПР до 14 мм - культура устойчива; более 14 мм - чувст­вительна; нистатин: диаметр ЗПР до 18 мм - культура устойчива; более 18 мм - чувствительна; клотримазол, флуконазол, кетоконазол: диаметр ЗПР до 12 мм - культура устойчива; более 12 мм - чувствительна.

2.1.15. Лиофилизация культур грибов рода Malassezia.

Работы по лиофилизации культур грибов проводились совместно с зав. Отделом лиофилизации ФГУ ВГНКИ Ю.Г. Опариным.

Подготовка взвеси дрожжевых клеток для последующей лиофилизации включала: выращивание культур грибов на питательных средах в матровых колбах в течение 7 сут. при 36°С; съем грибных культур с поверхности пита­тельной среды шпателем или скребком; приготовление взвеси грибных куль­тур в дистиллированной воде; смешивание взвеси грибных культур с защит­ной средой.

Использованные защитные среды: защитная среда №4ВГНКИ (состав: пептон - 5%, сорбит - 5%, желатин 1,3%); защитная среда для дрожжевых грибов (состав: молоко, инозит -5%).

Взвеси грибных культур смешивали с защитной средой в соотношении 1:1, после чего шприцами фасовали в ампулы (широкие типа ШПВ-6 (ИЛТ) или узкие типа ІШТВ-3 (ИББ) в объеме 1 см³. Ампулы закладывали в алюми­ниевую кассету и подвергали заморозке при -50°С. Лиофилизацию проводи­ли на установке GT-2 (фирма Finn-Aqua, Германия). После лиофильной суш­ки ампулы запаивали под вакуумом.

Контроль лиофилизированных культур грибов включал: определение наличия вакуума в ампуле на аппарате «Искра»; определение остаточной до­ли влаги в ампуле по ГОСТ 24061-89; определение наличия посторонних микроорганизмов методом посева ресуспензированных лиофилизированных культур на питательные среды МПА, МПБ, Китт-Тароцци, среду Чапека, среду Сабуро, сусло-агар; определение общей концентрации грибных клеток в ампуле методом подсчета грибных клеток в камере Горяева; определение концентрации жизнеспособных грибных клеток в ампуле при посеве ресус­пензированных лиофилизированных культур на питательные среды в чашках Петри методом серийных разведений с последующим учетом выросших ко­лоний грибов; определение изменчивости культуральных и морфологических свойств грибов до и после лиофилизации.

2.1.16. Статистическая обработка результатов исследований.

Статистическую обработку и интерпретацию полученных фактических данных проводили биометрическими методами по Г. Лакину с использовани­ем пакета анализа данных программы Microsoft Excel. Определяли следую­щие статистические характеристики:

- средняя арифметическая вариационного ряда, М;

- стандартное отклонение вариационного ряда, а;

- отклонение варианты от ср. арифметической вариационного ряда, М±т;

- t-критерий (t^) оценки достоверности различий (критерий Стьюдента) при уровне значимости р