Объекты и методы исследования Объекты исследования

0,05

0,5

вода водопроводная;

смесь КНрРОд и К_?НРОд

0,19

₃НК

мкг/мл

сНК

%

разведение «100%

мкг/мл

навеска (мг) *1000 Определение полисахаридов в биомассе.

1957). Количество сахара рассчитывали по калибровочному графику для построения которого использовали в качестве стандарта раствор

глюкозы.

Определение аминосахаров (хитина). Содержание хитина в био­массе определяли спектрофотометрическим методом по содержанию гексоэаминов ( Boas, 1953). Для этого, обезжиренную биомассу (10 мг) гидролизовали 6Н НС? (10 мл) в запаянных ампулах при 100° в течение 6-12 часов. В качестве стандарта использовали раствор Я -ацетил-глюкозамина.

Выделение и определение фракций полифосфатов (ПФ). ПФ выделя­ли из мицелия по методу Лангена и Лисса в модификации И. С.Кулаева (Нулаев с соавт.,1960). Для анализоа использовали I г сырой био­массы. Кислоторастворимые ПФ получали при экстрагировании биомас­сы в смеси IH и 0,5Н НСЕО^ в течение 15 мин. на холоду. Затем центрифугировали при 14 тыс. об/мин. 10 -15 мин. Экстракцию повто­ряли дважды. Супернатанты объединяли, нейтрализовали и доводили до определенного объема.

К осадку добавляли перхлорат натрия и 0,5 мл IH раствора НС?О^, суспендировали 15 мин. на холоду, затем прибавляли 10 мл воды, суспендировали еще 15 мин. и центрифугировали при 14 тыс. об/мин. Экстракцию повторяли дважды. Супернатанты, содержащие солераство­римые ПФ (ПФд) объединяли и доводили до определенного объема.

Затем освобождали биомассу от фосфолипидов.

Оставшийся осадок суспендировали в слабощелочном растворе на холоду в течение 15 мин. и центрифугировали при 14 тыс. об/мин. (10-15 мин.). Экстракцию повторяли дважды. Супернатанты, содер­жащие щелочерастворимые ПФ третьей фракции (ПФд) объединяли, нейт­рализовали и доводили до определенного объема.

Осадок суспендировали дважды по i5 мин. в 10 мл раствора 0,05М щелочи, центрифугировали при 14 тыс, об/мин.

Последнюю экстракцию вели на кипящей водяной бане в 10 мл ІН НССОд (2 раза по 20 мин). Центрифугировали при. 14 тыс. об/мин. Супернатанты, содержащие наиболее полимерные ПФ 5-ой фракции

(ПФ^) объединяли, нейтрализовали и доводили до определенного объе­ма.

Количество ПФ во всех фракциях определяли по лабильному фосфо­ру (Р лаб.) после 10-минутного гидролиза аликвоты экстрактов с 2Н

нее в кипящей водяной бане: Р лаб. = Р_1о Р_{ово6одаого}

ортофосфата

Ортофосфат во всех фракциях определяли по модифицированному методу Беренблюма и Чейна Wkit-HolberUe, С>гее.п, 1951).

Методы липидологии

Экстракция липидов из мицелия. Суммарные экстрагируемые липиды извлекали из биомассы по методу Фольча ( fWcA.ef.aA, 1957) с некоторыми модификациями. Биомассу гриба растирали в фарфоровой ступке и смешивали с 10-40 объемами смеси хлороформа с метанолом (в соотношении 2:1). Экстракцию вели 3-4 часа при постоянном пере­мешивании (на магнитной мешалке) до полного обесцвечивания биомас­сы. Для проверки полноты извлечения липидов проводили повторную экстракцию в течение 1-2 часов с последующим контролем на присут­ствие липидов методом тонкослойной хроматографии. Выявлено, что за 3-4 часа происходит практически полная экстракция липидов из биомассы гриба. Липиды отмывали от нелипидных примесей водой, от остатков воды освобождались, пропуская смесь липидов через безвод­ный сульфат натрия. Растворитель упаривали на роторном испарителе при 35-40°. Липиды сушили лиофильно до постоянного веса и рассчи­тывали их процентное содержание в абсолютно сухой биомассе.

Экстракцию "связанных” липидов проводили после выделения из биомассы суммарных экстрагируемых липидов. При этом использовали ту же смесь растворителей (хлороформ-метанол -2:1) с добавлением 1% (по объему) серной кислоты.

Анализ водно-метанольного слоя. В процессе отмывки водой хло- роформ-метанольного липидного экстракта, получали водно-метаноль- ный слой, в котором могли содержаться сильно полярные липидные соединения в смеси с нелипидными примесями и неорганическими со­лями.

Разделение липидов на классы. Для разделения суммарных липи­дов на классы использовали метод осаждения полярных липидов холод ным ацетоном (Кейтс,1975). Процентное содержание полярных и нейт­ральных липидов определяли гравиметрически.

Приготовление пластинок для тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Фракционный состав полярных липидов устанавливали методом ТСХ с использованием стеклянных пластинок размером 6^Х9 см с тонким сло­ем силикагеля, приготовленного по методу Светашева и Васьковского (SVe/asAeu, VcLskoviky, 1972). Силикагель марки КСКГ размалыва­

ли на шаровой мельнице в течение 48 часов и заливали дистиллиро­ванной водой.Суспензию перемешивали и оставляли на 3 мин., супер­натант сливали в другую колбу и оставляли последовательно на 10 и 45 мин. Надосадочную жидкость сливали и оставляли на 2 часа.

За это время осаждается фракция мелкого силикагеля, используемая для приготовления микропластинок. Суспензию силикагеля с гипсом наносили на пластинки, сушили на воздухе и активировали 30-60 мин при 110°.

В некоторых случаях пользовались стандартными пластинками для микроТСХ фирмы " Merfc " со слоем силикагеля 0,25 мы.

Фракционирование и идентификация липидов. Полярные липиды делили на фракции в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (65:25:4), а нейтральные липиды в системе петролейний эфир-диэти- ловый эфир-уксусная кислота (80:20:1). Идентификацию липидных фракций проводили с использованием стандартных препаратов липидов, а также по специфическим качественным реакциям на отдельные функ­циональные группы. С этой целью применяли!: реактив Васьковского (на фосфор), реактив Драгендорфа (на холин), раствор нингидрина (на А/ Н£ группу), раствор -нафтола и антроновый реактив (на сахара), раствор бромкрезолового зеленого (на свободные жирные кислоты), смесь ледяной уксусной кислоты с концентрированной сер­ной кислотой (на стеролы и их эфиры).

Реактивы готовились и использовались согласно правилам, изло­женным в руководстве Кейтса (ІУ75).

В качестве неспецифического обнаружителя применяли концентри­рованную серную кислоту, после обработки которой пластинки нагре­вали в сушильном шкафу до проявления липидных пятен.

Использование масс-спектрометрии для идентификации липидов.

С целью выяснения химической природы впервые обнаруженной фракции гликолипида, была проведена хроматографическая очистка фракции методом ТСХ и ее масс-спектрометрический анализ, сделанный Г.Л.Оси повым на квадрупольном масс-спектрометре " /А’СС Packard "5985.

Количественный анализ липидов. Количественное содержание от­дельных фракций липидов рассчитывали по денситограммам (Новицкая, 1972), полученным на экстинкционном регистрирующем приборе с ин­тегратором Е К З -65М с фотографических отпечатков размером 16X24 см, снятых с пластинок ТСХ.

Анализ жирных кислот. Метиловые эфиры жирных кислот получали методом кислого метанолиза на водяной бане при 80° в токе азота (5fei'n &t. оЯ.* 1976). Полученные метиловые эфиры отмывали во­дой до нейтральной реакции, используя в качестве растворителя гек­сан и пропускали через безводный сульфат натрия. Эфиры очищали методом препаративной хроматографии на пластинках размером 18x24 см в системе растворителей гексан-петролейный эфир (19:1). После обработки пластинок родамином 6Ж, фракцию метиловых эфиров жирных кислот собирали количественно и анализировали методом га­зо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) на приборе "Packard " при температуре 180°, на колонке с полиэтиленгликольадипатом на хро- мосорбе W. Кирные кислоты идентифицировали с использованием стан­дартных препаратов по времени удерживания компонентов анализируе­мой смеси. Количественное содержание отдельных жирных кислот (% от суммы) определяли по площади соответствующих пиков, полученных при фракционировании смеси жирных кислот (Прохорова, ред.,1982).

Определение р -каротина. I г сырой биомассы растирали с пес­ком в ацетоне и фильтровали через фильтр PI, процедура повторялась до полного обесцвечивания биомассы.

X!* Е «V * Ю⁴

Е^1% . м 1см

где

X - содержание каротина в 1г сухой биомассы,

Е - показания СФ при 450 нм,

V - объем гексанового экстракта,

Е^ - экстинкция 1% раствора чистого Ф -каротина в гексане: 1см _z

(2500),

1()4 - коэффициент пересчета, м - сухой вес взятой для анализа биомассы.

Расчет йодного числа»

Йодное число, характеризующее степень ненасыщенности липидов, рассчитывали по форцуле:

йодное число -------------------------------------

100% , где

а » для С_16;1 кислоты 90,0;

^с18:1 “ в⁶»⁰⁷

^С18:2. * 173,33

^СІ8їЗ - 2⁶¹»⁷⁹

^20:4 ^Л '■'» 333,5

в - содержание соответствующей жирной кислоты (% от суммы).

Еще по теме Объекты и методы исследования Объекты исследования:

1. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИССЛЕДОВАНИЯ ПАРАЗИТИЧЕСКИХ ПРОСТЕЙШИХ КИШЕЧНИКА
2. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. Психофизиологические методы исследования и их классификация
4. 2.5. Биожидкости как объекты исследования
5. 5.5. Классификация методов аналитических исследований
6. ГЛАВА 2. ПРОГРАММА, МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
7. Объекты и методы исследования
8. МЕТОДЫ И СИСТЕМЫ ВИРТУАЛЬНОЙ РЕАЛЬНОСТИ В НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
9. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ
10. Тема №1. Патологическая анатомия: объекты и методы исследования. Аутопсия. Патология клетки как интегративное понятие.
11. Тема занятия. ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ АНАТОМИЯ: СОДЕРЖАНИЕ, ЗАДАЧИ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. ВСКРЫТИЕ