Глава 2. Состав и содержание липидов 31 ігіірогл в зависимости от концентрации фосфатов в среде

Изучение условий образования и метаболизма липидов у грибов является крайне важным, т.к, открывает перспективы для направлен­ного синтеза липидов нужного состава.

Серия наших исследований была посвящена изучению взаимосвязи между концентрацией фосфора в среде и липогенезом у Lrispora.

Содержание суммарных экстрагируемых липидов в мицелии іп spora. . На используемых нами синтетических средах в клетках trispora в зависимости от условий культивирования и фазы разви­тия накапливалось от 8 до 31 г липидов в 100 г абсолютно сухой биомассы. При этом были выявлены некоторые закономерности в за­висимости от исходной концентрации фосфатов в среде (табл.1). Таблица I. Суммарное содержание липидов (% в абс.сух.биом.) в мицелии В?, trispora в зависимости от концентрации фосфатов в среде

Из таблицы видно, что количество липидов в условиях дефицита фосфатов составляло на разных средах в среднем от 8 до 14,5%.

Содержание и состав нейтральных липидов в мицелии trispora. .

Преобладающим липидным компонентом Rd-triipora являются нейт­

ральные липиды. Они составляли во всех вариантах опытов более 70% от суммы липидов, причем количество их могло достигать и более высоких значений (до 86%), особенно в стареющих культурах гриба.

Мы проанализировали фракционный состав нейтральных липидов, выде­ленных из мицелия Rft.tr! spor £ triipora , выращенного в условиях раз­личного обеспечения фосфатами: ІІ,У,УІІІ,ХІ,ХІУ - - дефицит фосфатов; III,У,IX,XII,ХУ - 0,05% фосфатов; ІУ,УІІ,Х, XIII, XVI - 0,5% фосфатов в среде. Анализ проводился через 41 (ІІ-ІУ, ХІ-ХІІІ), 65 (У-УІІ, ХІУ-ХУІ) и ИЗ (УІІІ-Х) часов культивирования гриба.

I - инокулят.

Фракционный состав: I - моноглицериды; 2 - диглицери­ды; 2 - стерины; 4 - свободные жирные кислоты;

5 - триглицериды; 6 - метиловые эфиры жирных кислот;

7 - эфиры стеринов; 8 - углеводороды; 9 - неиденти- фицированная фракция.

триглицеридов (рис.10,фракция 5) по сравнению с другими варианта­ми опыта. Содержание двух указанных фракций в ”0,5”Р варианте опыта повышалось лишь в 113-часовом мицелии гриба.

Содержание и состав полярных липидов в мицелии С>£ trispora .

На рис.II представлен фракционный состав полярных липидов, экстра­гированных из мицелия BL trispora выращенного при достатке и дефиците фосфатов в среде. Содержание полярных липидов в "+*’Р ва­рианте (0,1% фосфатов) мало изменялось в процессе культивирования гриба и составляло 25, 19 и 20,3% (от суммы липидов) после 48, 96 и 144 часов культивирования соответственно. В ”-"Р варианте (0,0045% фосфатов) полярные липиды достигали 29,2% (от суммы липидов) в 48-часовом мицелии и соответственно 21,3 и 14,9% в 96- и 144-часо- вом мицелии, т.е. количество полярных липидов в "бесфосфорном" ва­рианте снижалось за период культивирования в два раза. В составе полярных липидов было обнаружено Ю.фракций, из которых в поляр­ных липидах обоих вариантов присутствовали: фосфолипиды (рис.II, фракции 3,4,6 и 10), цереброзид (фракция 9.1, а также следовые ко­личества неидентифицированной фракции IP7. Главное отличив поляр­ных '.липидов клеток гриба, выращенного при дефиците фосфора, за­ключалось в наличии двух фракций (рис. II, фракции I и 2) с ^-рав­ным 0,065 и 0,13, отсутствующих в параллельном варианте после 48 часов роста. По реакциям со специфическими реагентами эти фракции идентифицированы как гликолипиды не содержащие фосфор. Кроме это­го, все образцы ”-”Р варианта имели в своем составе азот-содержа- щую фракцию (рис.II,фракция 8), которую не удалось обнаружить в образцах "+"Р варианта, а также бесфосфорную неидентифицированную фракцию (рис.II,фракция 5), которая была выявлена во всех образцах ”-”Р варианта и лишь в 144-часовом мицелии "+"Р варианта.

Таким образом, было показано, что исключение фосфатов из опыт­ной среды влечет за собой существенные качественные изменения во

* *•

Рис.II Фракционный состав полярных липидов, экстрагированных из мицелия BP.

i-ракционный состав: I и 3 -гликолипиды; 3 - фосфати- дилсерин (ФС); 4 - фосфатидилхолин (ФХ); 5 - бесфос­форная неидентифицированная фракция; 6 - фосфатидил- этаноламин (ФЭА); 7 - бесфосфорная неидентифицирован­ная фракция; 8 - бесфосфорная азот-содержащая фракция; 9 - цереброзид; 10 - фосфатидная кислота.

фракционном составе полярных липидов.

Количественное содержание отдельных фракций полярных липидов

BE trispora представлено в таблице 2.

Таблица 2. Содержание отдельных фракций полярных липидов BE trispora _в зависимости от обеспеченности среды фосфатами

фракции

варианты опыта (% фосфатов) возраст культуры (час)

содержание фракций (% от суммы полярных липидов)

"+"Р (0,1%) 96 ч 144 ч

"-"Р (0,0045%)

48 ч 96 ч 144 ч

46 ч

4.Фосфа­тидилхолин

0,31

б.Бесфос-

форная

фракция 0,4

6.

0,56

7.Бесфосфор- ная фракция

0,65

в.Бесфосфор- ная азот­содержащая фракция 0,73

9. Цереброзид

10.Фосфатид­ная кислота

- фракция не обнаружена: "-х-*¹ - не просчитано

Из таблицы видно, что преобладающими полярными липидами гриба являются фосфатидилэтаноламин (ФЭА) и фосфатидилхолин (ФХ), сумма которых в "+”Р варианте опыта составляла после 48 часов культивиро-

вания 78,39% всех полярных липидов, или 22,3 мг/1 г сухой био­массы. Была отмечена динамичность указанных фосфолипидов в про­цессе развития культурыпостепенное снижение уровня ФЭА и повы­шение содержания ФХ после 96 часов роста гриба, что, вероятно, связано с функциональными перестройками в клетке.

а,б; Ваггал, 1983).

В мицелии ^М-"Р варианта суммарное содержание ФЭА и ФХ снижа­лось почти в два раза по сравнению с "+"Р вариантом и составляло 36,46% от полярных липидов, или 8,5 мг/1 г сухой биомассы. Одно­временно при этом, отмечен усиленный синтез бесфосфорных компонен­тов в составе полярных липидов, среди которых преобладали гликоли*- пиды (фракции I и 2), составляющие 29,1% (т.е. почти 1/3) от всех полярных липидов. Эти фракции полностью отсутствовали в 48-часо- вом мицелии "+"Р варианта. Необходимо указать, что именно в этот период развития культуры была отмечена наибольшая разница в снаб­жении фосфатами клеток двух вариантов. Об этом свидетельствует максимальный разрыв в содержании доступного фосфора не только в среде, но и в мицелии (рис.12).Так, в "+"Р варианте фосфор в сре­де достигал 132 мкг/мл, в то время как в ”-"Р варианте отмечены лишь следы фосфора в среде. Содержание свободного ортофосфата в мицелии было около 5000 мкг в ”+”Р варианте и около 1600 мкг в "-”Р варианте в пересчете на 1г сухой биомассы. Содержание орто­фосфата в мицелии после 96 часов культивирования в *'+"Р варианте

Ряс.12 Содержание фосфора в среде (штриховая линия) и ' свободного ортофосфата в мицелии (сплошная линия) при культивировании ЬР. trispora в условиях достатка (I) и дефицита (2) фосфатов в среде

снижалось до уровня 1800 мкг/1г сух. биомассы, что практически совпадало с концентрацией ортофосфата в ”-”Р варианте, отмеченной после 48 часов роста. Это снижение свободного ортофосфата в ми­целии *’+”Р варианта коррелировало во времени с появлением в соста­ве полярных липидов указанного варианта гликолипидов (фракции I и 2), суммарное количество которых составляло 13,33% от полярных липидов. В то же время, содержание гликолипидов в мицелии ”-"Р варианта равнялось 25,3%. При дальнейшем развитии культуры (144 часа) содержание гликолипидов несколько снижалось и составляло 23,38% в ”-“Р и 8,05% (от суммы полярных липидов) в "+"Р варианте.

Кроме указанных отличий, в липидах "-”Р варианта отмечено большее содержание фракции 9 (рис.II), которая была идентифициро­вана как гликосфинголипид, принадлежащий к классу цереброзидов, о чем свидетельствует значение Rf, а также одинаковая хроматографи­ческая подвижность со стандартным препаратом цереброзида и качест­венные реакции на специфические группы.

Отмеченные выше закономерности синтеза полярных липидов у &Р. подтвердились и в следующей серии опытов по влиянию фосфатов, проведенных на синтетической среде другого состава (сре­да КЗ). фракционный состав полярных липидов, экстрагированных из мицелия гриба, выращенного в условиях различного обеспечения фос­фатами ("О", "0,05" и ”0,5"Р варианты), представлен на рис.13. Выявленные гликолипиды в данной серии опытов были представлены кроме цереброзида еще 7 фракциями (рис.13,фракции 1-5,7 и 9).

Данные о количественном содержании отдельных фракций полярных липидов приведены в таблице 3, из которой видно, что содержание фосфолипидов, представленных ФЭА, ФХ и ФС, в зависимости от кон­центрации экзогенного фосфата изменялось в 1,5-3 раза, составляя при достатке фосфора более половины всех полярных липидов, а при дефиците фосфатов от 35,5 (41-часовой мицелий) до 17,8% (113-часо-

• 2

4

I II Ш IV V VT VR VIIIIX X

Вйс.ІЗ Фракционный состав полярных липидов, экстрагированных из мицелия trispora , выращенного в условиях различного обеспечения фосфатами: II,У,УIII - дефицит фосфатов; ІІІ,УІ,ІХ - 0,05% фосфатов; 1У,УИ,Х - 0,5% фосфатов в среде. Анализ проводился через 41 (II,III, ІУ), 65 (У,У1,УП) и ИЗ (УШ,1Х,Х) часов культивиро вания гриба.

I-инокулят.

Фракционный состав: I - 5 - гликолипиды; 6 - ФС;

7 - гликолипид; 8 - ФХ; 9 - гликолипид; 10 - бесфос­форная неидентифицированная фракция; II - ФЭА;

12 - бесфосфорная неидентифицированная фракция;

13 - цереброзид.

вой мицелий).

сумма | і

фосфолипи- ; 55,7135,5 53,7 59,3 =-= і —4

24,5 58,8 52,1

17,8 57,1 52,5

сумма гли- і колипидов } 36.4

44.6 28.0 24.2|60.1 30.9 40.1 і 61.4 33.5 38.7

ГИХ ОЄСФОС-!

форных липи»^- 7 7j 19 2 15 4 14 8 дов 1 !

21,1 9,7 7,2

18,6 10,2 6,9

- фракция не обнаружена.

Таблица 3.Содержание отдельных фракций полярных липидов BL trispora при различной обеспеченности фосфатами

Соотношение индивидуальны?: фосфолипидов, как видно из таблицы, аналогично ранее описанно/лу: преобладают ФЭА и ФХ, при этом, как уже было отмечено, в процессе развития культуры уровень ФЭА пони­жается, а ФХ - повышается.

Общая сумма гликолипидов, включая гликосфинголипид (церебро­зид), составляла при дефиците фосфатов от 44,6 до 61,4% от суммы полярных липидов, а при наличии фосфатов в среде - от 24,2 до 40,1%.

Интересно отметить, что в составе липидов данной серии опытов, также обнаружены неидентифицированные бесфосфорные фракции (рис.13 фракции 10 и 12), содержание которых при дефиците фосфатов состав­ляло около 1/5 полярных липидов (18,6-21,5%). Особенно резкое раз­личие в содержании этих фракций в зависимости от концентрации фос­фатов в среде отмечено в процессе развития гриба. Так, после 65 и ИЗ часов культивирования их содержание при недостатке фосфатов было в 2 раза больше, чем в варианте ”0,05”Р и почти в 3 раза боль ше, чем в варианте "0,5"Р.(табл.З).

Из полученных результатов видно, что, адаптируясь к существо­ванию в бесфосфорной среде, гриб &P.lrisporQ. синтезирует поляр­ные липиды не имеющие в своей молекуле фосфора. В предложенных нами условиях эксперимента, преобладающими бесфосфорными липидами были гликолипиды ( до 60% от суммы полярных липидов), которые составляли в некоторых случаях в сумме с другими бесфосфорными ли­пидами более 80% от полярных липидов.(табл.З). Вместе с тем, дан­ные о суммарном содержании полярных липидов в мицелии tri spore.

свидетельствуют о том, что не наблюдалось резкой разницы в коли­честве полярных липидов при дефиците и достатке фосфора в среде (табл.4). При этом, как мы видели, доля фосфолипидов в составе по­лярных липидов ”-”Р варианта значительно снижалась. Можно думать, что бесфосфорные липиды, в частности гликолипиды, заменяют фосфо­липиды и поддерживают определенный уровень полярных липидов в клет­ке, что, вероятно, важно для функционирования мембранного аппарата.

Таблица 4. Содержание полярных липидов в клетках tri spore. в зависимости от концентрации фосфора в среде

возраст культуры варианты опыта (исходный % фосфатов)

(час) содержание полярных липидов (% от суммы ли-

пидов)

В серии экспериментов, поставленных по схеме "от спор", когда среды с различной исходной концентрацией фосфатов засевали не ве­гетативным мицелием, а непосредственно спорами, в составе полярных ЛИПИДОВ 66 irisporo. также были выявлены гликолипиды, причем, максимальное их количество (17,44% от полярных липидов) было об­наружено в "-"Р варианте опыта, в то время как гликолипиды в "0,05" и "0,5"Р варианах опыта составляли соответственно 8,13 и 7,12% от полярных липидов.

Кроме стимуляции синтеза бесфосфорных липидных компонентов дефицитом фосфатов в среде, была отмечена связь синтеза гликолипи­дов с определенными фазами развития гриба. Как отмечалось выше, (табл.2 и 3), в процессе культивирования fct.trizpora не наблю­далось постоянства в содержании гликолипидов в составе полярных липидов гриба. В некоторых условиях эксперимента мы наблюдали пол­ное исчезновение отдельных фракций гликолипидов (Рис.13,табл.3).

Мы полагаем, что процессы синтеза и распада гликолипидов происхо­дят в клетке постоянно и связаны с функциональными потребностями организма. Меняя условия культивирования, в частности концентра­цию фосфатов в среде,вызывающих как лимитацию или стимуляцию синтеза определенных компонентов, так и сдвиг в фазах развития, можно добиться преобладания одного процесса над другим. Выявлен­ная лабильность гликолипидов свидетельствует о высокой метаболи­ческой активности этих соединений.

Таким образом, при изучении полярных липидов гриба Z3Z⁷ irispora впервые обнаружены гликолипиды, отличные от цереброзидов и пока/ зано, что синтез гликолипидов стимулируется дефицитом фосфатов в среде на фоне снижения доли фосфолипидов в составе полярных липи­дов гриба.

Известны случаи,когда квалифицированное химическое изучение структуры, обнаруженных микробиологами неидентифицированных фрак­ций липидов привело к установлению вообще ранее не известных ли­пидных соединений, таких, например, как фосфатидил-2,3-бутандиол у Sir. otivaceus (fiatrakov аі.аі., 1974).

Несомненный интерес представляло выяснение химической природы выявленных нами гликолипидов.Была сделана попытка получить хрома­тографически чистую фракцию гликолипида, обнаруженного в клетках в наиболее значительных количествах (рис.II,фракция 2). Методом ТСХ была получена хроматографически гомогенная фракция, подвергну­тая масс-спектрометрическому анализу, проведенному Г.А.Осиповым на приборе фирмы " Hitt-Packard " 5985.

Масс-спвктрометрически были обнаружены жирные кислоты (Cj^.q, Сіб’О ^и ^18*0Дисахарид, а также соединение, идентифицированное по каталогу ЕРА/МІН Caiato^ о} Mass-Spectra (1979) как гете­

роцикл Podocarpo. или 8,11,13- trien - /6 - die ac/d, /3-і.іо-

ргоруР - rnei-hut, ether: ;

Pr

v He J

0

Рис.14 Масс-спектр гликолипидной фракции (рис.ІІ,фракция 2).

Составные компоненты: I - C_I4j0, 2 - C_I6;0, 3 - C_I8j0,

4 - дисахарид, 5 - "Podocarpa", 6 - стероид,

7 - тяжелые элементы липида.

Кроме того, во фракции предполагается наличие нестойкого соедине­ния стероидной природа (рис,14).

"Связанные" липиды trispora Приведенные выше результа­ты были получены на липидах, экстрагированных из биомассы смесью хлороформа с метанолом без гидролиза. Для таких липидов часто при­меняют термин "свободные" липида.

Известно, что некоторые липида могут быть более прочно связаны с компонентами клеток. Мы использовали кислотный гидролиз для из­влечения "связанных" липидов из биомассы BP.trispora . Было об­наружено, что в зависимости от условий культивирования и фазы раз­вития гриба, "связанные" липида могут составлять 1,3-6,8% от абсо­лютно сухой биомассы. Максимальное содержание "связанных" липидов отмечено при дефиците фосфатов (табл.5).

Таблица 5. Содержание "связанных" липидов в мицелии trispora. при различном обеспечении фосфатами

возраст культуры варианты опыта (исходный % фосфатов)

(час) содержание "связанных" липидов (% от абс,

сух.биомассы)

Преобладающими в составе "связанных" липидов в?, trispora. явля­лись нейтральные липиды, которые составляли до 90% от суммарных "связанных" липидов.Не было обнаружено никаких качественных разли­чий во фракционном составе нейтральных липидов в зависимости от снабжения клеток фосфатами, однако, отмечены некоторые особенности "связанных" нейтральных липидов гриба в отличие от "свободных" нейт­ральных липидов (рис.10).Во-1х,в составе "связанных" липидов обна­ружены метиловые эфиры жирных кислот, отсутствующие в "свободных" липидах (рис.10,фракция б). Кроме того, отмечено значительное сни­жение доли свободных жирных кислот (фракция 4),триглицеридов (фрак ция 5) и углеводородов (фракция 8) и одновременное повышение содер жания эфиров стеринов (фракция 7) в составе "связанных" нейтраль­ных липидов.

Глава 3. Влияние концентрации Фосфатов среды на другие физиолого-биохимические особенности Ы. trispora

в связи с синтезом липидов

Можно было ожидать, что дефицит экзогенного фосфора, вызываю­щий замену фосфолипидов гликолипидами в составе функционально ак­тивных полярных липидов, отразится и на других физиологических особенностях гриба trispora результаты исследования которых приведены ниже.

В связи с тем, что все процессы протекающие в клетках, в том числе и липогенез, непременно связаны с потреблением углеводного субстрата, а углеводный обмен теснейшим образом свяван с фосфор­ным обменом, - изучали взвамосвязь динамичности полифосфатов (ПФ) и потребления глюкозы грибом В£ trispora.

Интенсивнее всего сахар из среды утилизировался в том случае, когда исходная концентрация фосфатов была максимальной (в наших экспериментах 0,5%). Наиболее активное потребление глюкозы совпа­дало по времени с интенсивным потреблением фосфора из среды (рис. 15).

... Известна активная метаболическая роль ПФ клетки в углеводном и фосфорном обмене (Кулаев,1975). Влияние экзогенного фосфата на пул и динамичность ПФ практически не изучено. Анализ внутриклеточ­ных ПФ гриба Ьё. trispora показал, что увеличение концентрации экзогенного фосфата значительно повышает пул ПФ в клетке (табл.6)

Рис.15 Потребление глюкозы (штриховая линия) и фосфора (сплошная линия) в процессе развития В?, trispora на средах с различной исходной концентрацией фосфатов: I - дефицит фосфатов в среде; 2 - 0,05% фосфатов;

3 - 0,5% фосфатов

Таблица 6, Суммарное содержание ПФ в мицелии Sf. trispora в зависимости от обеспеченности фосфатами

возраст культуры варианты опыта (% фосфатов)

(час) содержание ПФ (в мг Р/1г сухой биомассы)

"+"Р ( 0,1%)^Н-^ПР (0,0045%)

Была выявлена способность гриба синтезировать фракции ПФ раз­личной степени полимерности, как низко-,,так и высокомолекулярные и отмечена динамичность отдельных фракций в процессе развития культуры (рис.16).

Контроль за потреблением сахара из среды с достатком фосфатов выявил обратную корреляцию между потреблением глюкозы и уровнем высокомолекулярных ПФ 4-ой фракции (ПФ^). Интенсивное потребление глюкозы сопровождалось распадом ПФ^, количество которых начинало резко возрастать после прекращения активного потребления сахара из среды (рис.17). Эти данные согласуются с гипотезой об участии ПФ, локализованных снаружи клеточной мембраны, т.е. высокомолеку­лярных ПФ, в переносе глюкозы в клетку. В настоящее время показа­но, что транспорт каждой молекулы в клетку сопровождается расщеп­лением ПФ (Кулаев,1975;1983).

Одновременно было отмечено, что накопление ПФ^ сочеталось во времени с появлением в составе полярных липидов гриба фракций гли колипидов.

Отмеченная корреляция наблюдалась также при дефиците фосфора в среде. При этом, на фоне резкого снижения суммарного пула ПФ (табл.б), преобладающей фракцией в их составе были ПФ₄ 162,3- -92,2% от суммы ПФ) (рис. 16). Именно в этих условиях отмечено максимальное количество гликолипидов в составе полярных липидов гриба.

Рис. 16 Содержание отдельных фракций ПФ в мицелии &t. trispora при культивировании на средах с достатком ("+"Р) и дефицитом (”-”Р) фосфатов: СШ - кислоторастворимая

фракция (лабильный Р); ? -солерастворимая фракция ■ - щелочерастворимая фракция (ПФд), ЕЗ - высокомолекулярная (Ий) щелочерастворимая фракция (ПФ4); Е2 - В?Л фракция, ПФ^

Рис.17 Потребление глюкозы из среды ( I и 2) и накопление внутриклеточных высокомолекулярных полифосфатов . (ПФд) ( Ґи 2^Z) в процессе культивирования Bt. trispora в условиях достатка (сплошная линия) и дефицита (штриховая линия) фосфатов в среде

- IOI -

Кроме того, в период активного роста культуры (48 часов) ус­тановлена прямая корреляция потребления фосфора из среды и на­копления наиболее полимерной 5-ой фракции ПФ (ПФ§). Очевидно, внешний фосфат сначала поступает в периферически расположенные фракции ПФ, к которым ,как известно,(Кулаев,1975), относятся ПФ§ Именно в течение 48 часов культивирования культура Е>Р. trispora потребляла максимальное количество ортофосфата среды: 86 мкгР/мл. Затем потребление было незначительным и составляло в последующие 48 часов 26 мкгР/мл, а к 144 часу роста гриба - 8 мкгР/мл. В это же время происходило перераспределение внутриклеточного фосфора в полифосфатах различной степени полимерности (рис.16).

Таким образом,выявлена коррелятивность процессов потребления грибом глюкозы и фосфора среды и накопления в клетках определен­ных фракций ПФ и полярных липидов.

Интересно также отметить, что солерастворимая фракция полифос­фатов (ПФ£) была выявлена только в "+"Р варианте, при этом, коли­чество ее было минимальным в 48-часовом мицелии, т.е. когда проис­ходило активное потребление фосфора и глюкозы из среды, а затем (в 96-часовом мицелии) возрастало более, чем в 300 раз (рис.16).

К настоящему времени выяснено,что может существовать два пула со­лерастворимых ПФ: одни локализованы на ядре и синтез их коррелиру­ет с синтезом нуклеиновых кислот (Нрицкий с соавт.,1969;Кулаев, 1975), а другие накапливаются в вакуолях и являются запасным мате­риалом ( HuJaev, 1979). Поскольку нам не удалось выявить положи­тельной связи между накоплением П$£ и синтезом нуклеиновых кислот и, более того, была прослежена четкая обратная зависимость между этими процессами (рис. 18), можно, по-видимому считать, что yBfirU spora солерастворимые ПФ. относятся к вакуолярному типу, т.е. гриб обладает способностью резервировать большое количество фосфора в форме ПФ средней степени полимерности.В связи с этим становится

Ftac«I8 Динамика синтеза нуклеиновых кислот. (I) и

накопления солерастворимой фракции полифосфатов (П&Р (2) в процессе культивирования BP. trispora на среде с достатком фосфатов

понятным полное отсутствие этой резервной фракции в условиях не­достатка фосфора в среде.;

Таким образом,в составе полифосфатов у Bf. trisporo. впервые описанных в данной работе, преобладающими фракциями являются высокомолекулярные ПФ (ПФ₄ и ПФ§) и резервная солерастворимая фракция (ПФ£)» Установлена обратная корреляция между уровнем ПФ₄ и потреблением глюкозы из среды и прямая корреляция между уровнем ПФ^ и потреблением фосфора из среды в период активного роста гриба

Было отмечено, что дефицит фосфатов, вызывая некоторое сниже­ние интенсивности потребления глюкозы из среды, не препятствовал однако, активному накоплению биомассы гриба. Как показали сравни­тельные анализы, количество биомассы в ”-”Р вариантах опытов в ряде случаев достигало или даже превышало уровень ее в "+"Р ва­риантах. Чтобы выяснить за счет каких компонентов клеток происхо­дило накопление биомассы гриба при дефиците фосфатов, определяли содержание белка, липидов, а также активно синтезируемого грибом продукта так называемого вторичного метаболизма - р -каротина.

Из полученных данных следовало, что накопление биомассы в ”-"Р ва­риантах не связано с синтезом белка, липидов или -каротина (рис.19 и 20а,б). При этом было выявлено, что экзогенный фосфат влияет на уровень каротиноидов и показана прямая положительная за­висимость между количеством пигмента в клетках и содержанием фосфа тов в среде. В предложенных условиях эксперимента максимальное ко­личество -каротина отмечено на среде с исходной концентрацией фосфатов 0,5% (рис.206).

Можно было ожидать, что высокий уровень биомассы в условиях недостатка фосфатов в среде могут обеспечить углевод-содержащие компоненты клеток. Определения этих компонентов показали, что при дефиците фосфатов гриб активно накапливает полисахариды,в состав которых входят нейтральные сахара,составляющие почти половину веса

Рис.19 Накопление биомассы (I) и содержание в ней белка (2) и полисахаридов (3) в процессе развития В£ігї&рога на средах с различной исходной концентрацией фосфатов: а) дефицит фосфора в среде; б) исходная концентрация фосфатов 0,05%; в) исходная концентрация фосфатов 0,5%. ? - биомасса (сухая) г/100 мл среды;

▲ - полисахариды (нейтральные сахара); г/100г сух.биом., ■ - белок г/100г сух.биом.

41 65 ИЗ час

Рис.20 Накопление липидов (а) и -каротина (б)

в мицелии nt. trispora в зависимости от кон­центрации фосфатов в среде: I -?- дефицит фос­фатов; 2 - исходная концентрация фосфатов 0,05%;

3 - ИГ- исходная концентрация фосфатов 0,5%

сухой биомассы (47,7%), причем, удвоение содержания нейтральных сахаров с 23,1 до 47,7% (от абс.сух.биом.) сопровождалось увеличе­нием количества биомассы с 0,38 до 0,64 г/100 мл среды (рис.19а). Эти данные говорят о том, что именно за счет увеличения углевод­ных компонентов, в данном случае нейтральных сахаров, составляющих у грибов полисахаридный матрикс клеточной стенки, накапливался вы­сокий уровень биомассы при дефиците фосфатов в среде.

В "+"Р вариантах опытов подобного соответствия не наблюдалось (рис.196,в).

Полученные данные согласуются с литературными сообщениями ( bartnicKi-Ga.rc.ia, 1968; farha£,ly?9 ) о том, что в клеточной

стенке наиболее лабильным компонентом являются полисахариды матрик­са, т.е. нейтральные сахара. В то же время хитин, являющийся ком­понентом остова клеточной стенки, более стабилен. Действительно, при культивировании гриба на синтетической среде ІРЗ нам не удалось отметить особой разницы в содержании хитина (гексозаминов) в клет­ках, где резко менялось содержание нейтральных сахаров (таблица 7). Таблица 7. Содержание гексозаминов в мицелии 6Е trispora.

в условиях различного обеспечения фосфатами

Однако в опытах, проведенных на другой среде (К^2) был отмечен факт увеличения хитина в клетках, выросших при дефиците фосфатов в 3,4 раза по сравнению с ”+’*Р вариантом: с 570 до 1940 мг в 100 г сухой биомассы. Вероятно, та или иная лабильность компонентов кле­точной стенки зависит и от состава сред.

Выявленные в клетках trispora биохимические особенности согласуются с электронно-микроскопическими наблюдениями ультра- структурной картины гиф гриба. Изменение в содержании отдельных компонентов клеточной стенки, а именно удвоение содержания нейт­ральных сахаров сопровождалось увеличение?^ вдвое толщины клеточной стенки ( с 300-1000 нм до 700-2000 нм) ( рис.8а,б,в).

Если сопоставить накопление полисахаридов с синтезо?л гликоли­пидов, то можно отметить явную корреляцию этих процессов. Так, об­наружение гликолипидов в составе полярных-'липидов гриба сочеталось с активным синтезом полисахаридов вариант) или со стабилиза­

цией содержания этих полимеров (”+’’Р варианты). Особенно высокая степень корреляции наблюдалась при дефиците фосфатов в среде (рис. 21а), при этом было отмечено, что накопление гликолипидов пред­шествовало во времени накоплению полисахаридов. При добавке фосфа­тов в среду характер взаимосвязи двух указанных процессов несколь­ко изменялся, однако и в этих случаях были выявлены отмеченные выше корреляции (рис.216,в).

Таким образом, выявлена взаимосвязь синтеза гликолипидов, с одной стороны, с накоплением полисахаридов и с другой - с накоп- ление?л высокомолекулярных полифосфатов (ПФ^). О существовании со­пряженных механизмов биосинтеза полисахаридов клеточной стенки и наиболее полимерных ПФ, в частности ПФ^, у дрожжей, известно (Вагабов с соавт.,1973;Шабалин с соавт.,1978). Кроме того, не вы­зывает сомнений локализация ПФ в клеточной стенке мукоровых грибов, у которых количество этих соединений может достигать 10-20% в со­ставе компонентов клеточной стенки (Кулаев с соавт.,1979). С дру­гой стороны, в настоящее время установлено, что в биосинтезе всех основных углевод-содержащих биополимеров клеточной стенки микроор­ганизмов участвуют липиды.

Поскольку обнаруженные нами гликолипиды не содержат фосфор,

Вис.21 Наяжниния в содержании полисахаридов и гликолипидов в процессе культивирования ВС trispora на средах с различным содержанием фосфатов: а) дефицит фосфатов в среде; б) исходная концентрация фосфатов 0,05%; в) исходная концентрация фосфатов 0,5% (сплошная линия - содержание полисахаридов, штриховая - содержание гликолипидов).

D -гликолипиды - % от суммы полярных липидов;

В -полисахариды (нейтральные сахара) - % от абс.сух.б.

трудно представить их участие в синтезе полисахаридов по цикличес­кому механизму известному для фосфор-содержащих липидных перенос­чиков (Кулаев с соавт.,1982). В то же время нельзя исключить дру­гие пути их участия. В связи с этим важно отметить, что сравнитель­но недавно у водного гриба отапопИ была обнаружена бес­фосфорная липидная "затравка”, на которой происходит сборка хитина. Структурно липид представлен гликолипидом гликозилдиглицерольного типа (Mitts, Co-ntiпо, 1978). Участие гликолипида в синтезе поли­сахаридов в качестве инициатора предполагает заметное снижение со­держания липида в момент максимального накопления полисахаридов.

В наших экспериментах, напротив, накопление полисахаридов сопро­вождалось усиленным синтезом гликолипидов (рис.21а). Отмеченные наїли выше закономерности больше всего оснований дают для предполо­жения, что обнаруженные у ВС trispora гликолипиды выступают как своеобразные ко-факторы, активирующие реакции биосинтеза полисаха­ридов. Из литературы известно (Кулаев с соавт.,1982), что мембран­ные фосфолипиды могут выполнять функцию ко-факторов некоторых био­логических процессов. В наших экспериментах в условиях резкого сни­жения фосфолипидов, функцию ко-факторов могут выполнять, по всей видимости, обнаруженные гликолипиды.

Результаты работы по изучению влияния экзогенного фосфора на особенности развития гриба bt. trispora- показали, что от заданных в среду концентраций фосфатов зависят как морфологические, так и физиолого-биохимические характеристики гриба, йлявлено влияние эк­зогенного фосфата на процессы прорастания спор гриба и роста гиф мицелия, на ультраструктурную организацию клеток, а также на био­химические характеристики, такие как содержание функционально ак­тивных фракций полифосфатов, компонентов липидного слоя мембран и полисахаридов клеточной стенки.

В заключении главы отметим, что для описания синтеза обнару-

- ио

женннх гликолипидов нами предложена математическая модель.

Динамика процесса выражена в форме системы дифференциальных уравнений 1-го порядка и учитывает корреляцию синтеза гликолипи­дов с уровнем свободного ортофосфата в мицелии tnsрога , а также с концентрацией фосфора в среде.

Модель позволяет описывать качественные и количественные за­кономерности синтеза гликолипидов и делать выводы о возможном протекании данного процесса в различных условиях эксперимента.

Описание математической модели дано в приложении к работе.