Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Торможение прогрессирования хронического гломерулонефрита и отдаление хронической почечной недостаточности является одной из основных задач современной нефрологии, решение которой имеет не только медицинское, но и важное экономическое и социальное значение, что определяется заболеваемостью преимущественно трудоспособного населения и потребностью в дорогостоящей заместительной почечной терапии на стадии терминальной ХПН.

В последние годы предметом детального изучения в нефрологии являлись, главным образом, повреждающие факторы в прогрессировании хронического гломерулонефрита [2, 30, 68, 96]. Однако, выраженность повреждения почечной ткани, особенности течения и исход ХГН зависят от баланса локально воздействующих повреждающих факторов (воспалительных и профиброгенных цитокинов, кислородных радикалов, компонентов комплемента и т.д.) и противостоящих им механизмов самозащиты почки [14, 63]. В области защитных систем организма, в том числе локально-почечных, представляет интерес изучение белков теплового шока.

Среди белков теплового шока при ХГН особый интерес представляют БТШ-27, регулирующий структуру и функцию актин-содержащих клеток почки (подоцитов и тубулярных клеток), а также БТШ-70, который, как полагают, помимо внутриклеточной защиты, участвует в регуляции иммунного воспалительного ответа.

По нашим данным, экскреция БТШ-27 и -70 с мочой увеличивалась по мере нарастания активности ХГН, достигая наиболее высоких значений у больных с НС, особенно при его тяжелом течении. Нами установлены прямые корреляции мочевых показателей БТШ-27 и БТШ-70 с клинической активностью нефрита, в первую очередь, с выраженностью ПУ и почечной дисфункции, что отражает активацию механизмов внутриклеточной защиты

в ответ на действие повреждающих факторов. В этой связи повышенный уровень БТШ в моче можно рассматривать не только как показатель индукции синтеза этих защитных белков в различных клетках ткани почки, но и как косвенный маркер клеточного повреждения.

Наиболее тесная связь с тяжестью НС была получена для БТШ-27, что находит объяснение в свете современных представлений об участии этого белка в поддержании цитоскелета подоцитов, и в частности, в регулировании формы его ножек – ключевого звена развития нефротической ПУ. Установлено, что защитными свойствами обладают нефосфорилированные олигомеры БТШ-27. В процессе клеточного повреждения происходит их фосфорилирование с помощью р38 МАР-киназы, что влечет за собой потерю связи БТШ-27 с актиновыми микрофиламентам и ремоделирование актиновой сети в клетке [81, 106]. В результате этих процессов наблюдается слияние ножек подоцитов с развитием ПУ, поврежденные подоциты слущиваются в мочевое пространство (подоцитурия), а БТШ начинают интенсивно выделяться из поврежденных клеток в мочу [19, 114]. Важную роль БТШ-27 играют в поддержании цитоскелета и других актин- содержащих клеток почек – канальцевых эпителиоцитов. Ослабление защитных свойств БТШ-27 в поврежденных эпителиальных клетках приводят к нарушению их каркаса, полярности, межклеточных контактов и связи с тубулярной базальной мембраной с последующим слущиванием эпителиоцитов в просвет канальца и формированием в местах оголения мембраны очагов тубулоинтерстициального фиброза.

В семейство БТШ-70 входят конституциональный белок БТШ-73 кДа и индуцибельный белок БТШ-72 кДА. В эксперименте установлено, что БТШ-

73 в норме экспрессируется преимущественно клетками дистальных канальцев, в меньшей степени – проксимальных, а БТШ-72 – вдоль кортикопапиллярных областей [66]. При патологических состояниях экспрессия БТШ-73 и -72 локализуется преимущественно в области

повреждающего воздействия. Так, при экспериментальном PAN-нефрозе внутриклеточная экспрессия БТШ-73 обнаруживалась в подоцитах, являющихся мишенью повреждения при данной форме нефрита, а также в тубулярных клетках, отражая их защитную реакцию на токсическое действие нефротической ПУ [66]. При экспериментальном остром повреждении почек ишемической и токсической природы усиленная экспрессия БТШ-73 и -72 выявлялась в проксимальных тубулярных клетках [29, 67, 89].

В настоящее время имеются лишь единичные работы, посвященные изучению экспрессии БТШ-70 в ткани почки у больных различными формами ХГН. Выявлена депозиция БТШ-70 в подоцитах, тубулярных клетках дистальных канальцев и собирательных трубочек, в очагах интерстициальной инфильтрации [129]. Активация экспрессии БТШ клетками почек установлена у больных с различными морфологическими формами ХГН (МИ, ФСГС, МН), а также при остром интерстициальном нефрите в очагах инфильтрации [129]. Напротив, при прогрессирующем хроническом воспалении с развитием фиброза значительного повышения экспрессии БТШ клетками ткани почек не отмечено.

В нашем исследовании экспрессия БТШ-70 обнаружена у всех больных ХГН с выявленной экскрецией БТШ-70 с мочой. В целом, изменения тканевых и мочевых показателей БТШ-70 у больных ХГН были однотипны: отмечалась интенсивная экспрессия этого фактора в почке и усиленная его экскреция с мочой при активных формах ХГН, главным образом, при НС. Полученные нами данные подтверждают локально-почечное происхождение БТШ-70, выявляемого в моче, и указывают на возможность использования

мочевых показателей БТШ для оценки механизмов защиты в почке и выраженности повреждения.

Экспрессия БТШ-70 выявлена нами у больных ХГН в разных структурах ткани почки, но преимущественно в тубулоинтерстиции, что согласуется с результатами исследований других авторов. Интенсивность тубулоинтерстициальной экспрессии БТШ-70 коррелировала с уровнем экскреции БТШ-70 с мочой. Наиболее выраженная окраска на БТШ-70 у больных с НС выявлялась в эпителиальных клетках канальцев, прямо коррелируя с выраженностью ПУ. В свете современных представлений о механизмах нефротоксичности ПУ, это можно расценивать как защитную реакцию тубулярных клеток в ответ на повреждение не только иммунными факторами, но и компонентами ПУ.

Мы оценили баланс про- и противоспалительных интерлейкинов (ИЛ-6 и ИЛ-10) в моче больных ХГН в сопоставлении с изменениями мочевых показателей БТШ.

Экскреция с мочой ИЛ-6 в группах больных активным ХГН была достоверно выше, чем у здоровых и пациентов с латентным течением заболевания. Она прямо коррелировала с величиной протеинурии и длительностью сохраняющейся активности ХГН и обратно – с общим белком сыворотки крови и альбумином. У больных ХГН с НС средний уровень ИЛ-6 в моче превышал таковой у пациентов с МС. При отдельном анализе показателей у больных ХГН с НС было установлено, что при выраженном НС экскреция ИЛ-6 с мочой была достоверно выше, чем у пациентов с умеренным НС.

Мы установили, что у тех больных ХГН, у которых наряду с НС выявлялось преходящее нарушение функции почек (как проявление высокой активности заболевания), уровень ИЛ-6 в моче был более высоким, чем у пациентов с изолированным НС, независимо от его степени тяжести. У больных ХГН с НС мочевой показатель ИЛ-6 коррелировал прямо с

величиной сывороточного креатинина и обратно с СКФ. В исследовании Horii Y. и соавт. было показано, что постоянно высокий уровень ИЛ-6 в моче выявлялся у больных с морфологическими признаками прогрессирования ГН [59]. При этом уровень ИЛ-6 в моче не коррелировал с уровнем ИЛ-6 в сыворотке крови, свидетельствуя о локально-почечном происхождении данного цитокина.

При нарастании активности ХГН (формировании НС, усугублении его тяжести) наряду с увеличением экскреции ИЛ-6 отмечалось повышение уровня в моче БТШ-27 и БТШ-70. В группе больных ХГН с НС установлена прямая достоверная корреляция между уровнями в моче провоспалительного цитокина ИЛ-6 и протективного БТШ-27. Полученные нами результаты подтверждают установленную в эксперименте активацию синтеза защитных БТШ в ответ на воздействие повреждающих, в том числе, воспалительных цитокинов (индуцированная защита), направленных на ограничение структурных повреждений клеток [35].

Активация провоспалительных/эффекторных факторов и противовоспалительных механизмов, направленных на ограничение воспаления, по-видимому, происходят параллельно, о чем свидетельствуют полученные нами прямые сильные корреляции между уровнями белков теплового шока и воспалительного ИЛ-6.

Изменения уровней в моче про- и противовоспалительных интерлейкинов у больных активным ХГН носили разнонаправленный характер: при росте экскреции ИЛ-6 у пациентов с МС, и особенно c НС, отмечалось резкое снижение экскреции ИЛ-10. Наибольший дисбаланс

мочевых показателей ИЛ-6 и ИЛ-10 наблюдался при высокоактивном течении ХГН с выраженным НС, в том числе в сочетании с нарушением функции почек.

Комплексный анализ изменений изученных мочевых показателей на разных стадиях течения ХГН показал, что с нарастанием активности заболевания от МС к НС разной степени выраженности наблюдается увеличение уровня в моче воспалительных и снижение противовоспалительных цитокинов, а также активация синтеза защитных белков теплового шока, что имеет, по-видимому, адаптационный характер в условиях персистирующего воспаления в почке.

Мы полагаем, что прогрессирование ХГН может рассматриваться как состояние дезадаптации, характеризующееся несостоятельностью внутренних защитных механизмов почки в ответ на возрастающее воздействие медиаторов повреждения.

Суммируя полученные нами данные по показателям экскреции с мочой белков теплового шока-27 и -70, а также цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-10 у больных ХГН, можно предположить, что по мере нарастания активности нефрита (в первую очередь, протеинурии от субнефротической до нефротического уровня) увеличивается внутриклеточный синтез и экскреция БТШ-27 и -70 с мочой, параллельно отмечается рост в моче ИЛ-6 как показателя активации эффекторного звена иммунного воспаления в почке, в то время как уровень противовоспалительного ИЛ-10 в тех же группах больных, наоборот, прогрессивно снижается до нулевых значений.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что у пациентов с активным ХГН имеет место активация системы самозащиты – синтеза белков теплового шока на внутриклеточном уровне в поврежденных клетках. Помимо выполнения функции внутриклеточной защиты (в качестве белков- шаперонов) обсуждаются и внеклеточные эффекты БТШ. Известно, что БТШ-70, помимо повышения содержания внутри клеток, может

высвобождаться во внеклеточную среду или экспрессироваться на поверхности клеток с помощью системы MCH [37], и в этом случае их особая протективная роль заключается в контроле хронического иммунного воспаления. Впервые протективная роль БТШ при воспалительных заболеваниях была продемонстрирована при введении экспериментальным животным с аутоиммунным артритом БТШ-60, оказывавшим противовоспалительный эффект [126]. В дальнейшем было показано, что расположенные внутриклеточно БТШ при воспалении и повреждении клеток могут экспрессироваться на их поверхности или выделяться во внеклеточное пространство [90]. Эпитопы собственных БТШ, экспрессируемых в очаге воспаления, распознаются Т-клетками, что приводит к формированию регуляторных противовоспалительных клонов реактивных Т клеток [27], а именно CD4+CD25+ регуляторных клеток (Трег) [44]. Противовоспалительный интерлейкин-10 одним из первых выделяется регуляторными клетками в очаге воспаления, он является основным противовоспалительным цитокином, опосредующим многие иммунорегуляторные эффекты БТШ [98]. В результате отмечается

«переключение» Th1 фенотипа на Th2 c уменьшением секреции фактора некроза опухоли a и интерферона g и повышением уровня противовоспалительных ИЛ-10 и ИЛ-4 [133] не только в Т-лимфоцитах, но также и в мононуклеарных клетках – моноцитах и дендритных клетках [45].

Для оценки иммунорегуляторной функции БТШ мы изучили уровень циркулирующих АТ к БТШ-70 в сыворотке крови и определили в инфильтратах ткани почек количество регуляторных Т-лимфоцитов по экспрессии ими фактора транскрипции FoxP3.

В настоящее время в нескольких исследованиях продемонстрировано увеличение уровня антител к БТШ, в том числе к БТШ-70, при иммунных и аутоиммунных заболеваниях (ревматоидном артрите, васкулитах и др.). В

литературе обсуждается значение этого показателя в оценке активности заболеваний [48, 137].

В нашем исследовании сывороточный уровень антител к БТШ-70 у больных активным ХГН (как с мочевым, так и с НС) был значимо выше, чем у пациентов с латентным течением заболевания. В общей группе пациентов с НС величина данного показателя была несколько ниже, чем при мочевом синдроме, и обратно коррелировала с величиной суточной протеинурии, более сильная связь отмечена в группе больных с выраженным НС.

Статистически достоверное снижение уровня антител к БТШ-70 выявлялось при прогрессирующем течении нефрита, клинически характеризующимся сочетанием выраженного НС с преходящим нарушением функции почек как проявлением высокой активности заболевания, что, по-нашему мнению, подчеркивает значение нарушений иммунорегуляторных эффектов БТШ и недостаточности противовоспалительной защиты почки в целом при прогрессирующих формах нефрита. На это указывают и результаты проведенного нами морфометрического исследования.

Мы не выявили зависимости уровня антител к БТШ-70 в сыворотке крови от морфологического варианта нефрита, величина этого показателя (подобно мочевому), главным образом, определялась клинической картиной заболевания.

С помощью морфометрического подсчета FoxP3-положительных ядер мы оценили число противовоспалительных клеток в ткани почки.

FoxP3 экспрессировался преимущественно в интерстициальных воспалительных инфильтратах ткани почки, а также выявлялся в строме и клубочках.

У больных ХГН с НС, по сравнению с пациентами с МС, отмечалось достоверное снижение в ткани почек FoxP3-положительных клеток, и именно

в этой группе пациентов мы выявляли резкое снижение уровня ИЛ-10 в моче и АТ к БТШ-70 в сыворотке крови.

Важным аспектом изучения любых неинвазивных показателей является определение возможности с их помощью прогнозировать течение болезни. Полученные нами данные и результаты экспериментальных исследований других авторов позволили предположить, что неэффективная регуляция хронического иммунного воспаления у больных ХГН, в том числе с участием БТШ, может способствовать персистированию и дальнейшей хронизации болезни, и напротив, при состоятельности этой системы можно прогнозировать более благоприятное течение нефрита. Мы проанализировали ответ на иммуносупрессивную терапию у 37 пациентов с активным течением ХГН (12 больных с мочевым синдромом и 25 больных с НС) в зависимости от исходной величины уровня АТ к БТШ-70. Купирование НС и/или достижение ремиссии ХГН в течение ближайших месяцев иммуносупрессивной терапии наблюдалось у больных с высоким (выше 21 пг/мл) исходным уровнем антител к БТШ-70 в сыворотке крови. Так, у 13 из 16 (81%) пациентов с высоким уровнем антител ответ на лечение был получен в течение 12 месяцев, у 50% – в течение ближайших 5 месяцев. Напротив, у 12 из 21 (57%) пациентов с титрами антител ниже 21 пг/мл НС персистировал, несмотря на проводимое более года лечение, рекомендованное для данных форм заболевания. В этой связи низкий уровень антител к БТШ-70 можно рассматривать как неблагоприятный прогностический признак, указывающий на риск хронизации или прогрессирования болезни.

Мы полагаем, что снижение уровня циркулирующих антител к БТШ- 70 у больных прогрессирующими формами ХГН может отражать, с одной стороны их неадекватно низкую продукцию, с другой, их потребление при формирования комплексов «антиген-антитело» (БТШ-70-АГ/БТШ-70-АТ) в процессе иммунного воспаления. Однако, по данным нашего исследования,

независимо от подлежащих механизмов, снижение уровня антител к БТШ-70 в системном сосудистом русле у больных ХГН является прогностически неблагоприятным признаком, отражающим в целом неэффективную иммунорегуляцию хронического иммунного воспаления с участием БТШ70 у больных тяжелыми формами нефрита, что указывает на риск дальнейшего персистирования болезни.

Патогенетическое значение и прогностическая роль АТ к БТШ-70 при иммунной патологии изучены пока еще недостаточно. Имеется ряд исследований, демонстрирующих увеличение титра АТ к БТШ, в том числе к БТШ-70, при иммунно-воспалительных и аутоиммунных заболеваниях (системной красной волчанке, ревматоидном артрите, васкулитах, дерматомиозите и др.) [134]. Мухин Н.А. и соавт. показали увеличение уровня АТ к БТШ-70 в сыворотке крови у больных ХГН и амилоидозом с НС [18]. В нескольких исследованиях подтверждено значение уровня АТ к БТШ- 70 в сыворотке крови как предикторов неблагоприятного прогноза у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями и атеросклерозом. Так, Zhanq X. и соавт. показали, что высокое содержание БТШ-70 в сыворотке крови в сочетании с низким титром АТ к БТШ-70 ассоциировано с высоким риском прогрессирования атеросклероза и сердечно-сосудистых осложнений в популяции [137]. По данным Dulin E. и соавт., снижение уровня циркулирующих АТ к БТШ имеет неблагоприятное прогностическое значение при ишемической болезни сердца [48].

Комплексный анализ изменений всех изученных нами мочевых и сывороточных тестов на разных этапах течения ХГН показал, что при нарастании активности заболевания (прежде всего, увеличении ПУ) в ответ на активацию факторов повреждения (увеличение уровня в моче воспалительного ИЛ-6) наблюдаются адаптивные изменения в системе самозащиты почки – усиленная экскреция с мочой БТШ- 27 и БТШ-70, рост уровня в моче противовоспалительного ИЛ-10, а в сыворотке крови – АТ к

БТШ-70 (как отражение активации внутри- и внеклеточных защитных эффектов БТШ). При прогрессирующем течении ХГН (развитии НС, усугублении степени его тяжести, особенно в сочетании с нарушением функции почек) баланс повреждающих и защитных механизмов нарушается: при продолжающемся росте уровня ИЛ-6 в моче и увеличении экскреции с мочой БТШ-27 и БТШ-70, наблюдается резкое снижение уровня ИЛ-10 в моче (вплоть до неопределяемых значений) и уменьшение АТ к БТШ-70 в сыворотке крови, что отражает ослабление иммунорегуляторных и противовоспалительных эффектов БТШ. Такой спектр биомаркеров указывает на риск дальнейшего прогрессирования воспалительных изменений в почке и худшего ответа на лечение.