Глава 6. ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ДИСУЛЬФИДОВ ГЛУТАТИОНА В ПРОФИЛАКТИКЕ И ТЕРАПИИ ХИМИОЛУЧЕВЫХ ОРАЛЬНЫХ МУКОЗИТОВ (обсуждение полученных результатов)

В настоящее время одним из основных подходов в лечении рака орофарингеальной области является химиолучевая терапия, ведущим осложнением которой является оральный мукозит. По данным [50, 51], у 100% больных раком головы и шеи химиолучевая терапия вызывает развитие орального мукозита по сравнению с 60% у тех пациентов, кто получает только химиотерапию [117, 118, 119].

Болевой синдром и отечность, связанные с оральным мукозитом [270], могут привести к длительному нарушению функции глотания и прерыванию химиолучевой терапии. В среднем около 20% пациентов с раком головы и шеи нуждаются в незапланированных перерывах в химиолучевой и химиотерапии. Незапланированное прерывание противоопухолевого лечения и вынужденная редукция дозы терапии может снизить эффективность лучевой или химиолучевой терапии и увеличить риск прогрессии опухоли, что отразится на качестве жизни и выживаемости больных [300, 301, 303].

Для успешного поиска высокоэффективных средств профилактики и лечения данной патологии возникла необходимость в разработке экспериментального лучевого и химиолучевого оральных мукозитов, которые отражали бы симптоматику осложнений противоопухолевого лечения орофарингеального рака у онкологических больных.

Проведенные нами исследования показали, что введение экспериментальным животным (крысам) алкилирующего цитостатика цисплатина в максимально переносимой дозе 7 мг/кг (не вызывающей развитие орального мукозита), с последующим кранио-каудальным у- облучением в дозе 10 Гр на область головы способствовали формированию у животных клинических проявлений орального мукозита, с максимальной симптоматикой на 15 сутки после радиационного воздействия.

В литературе данные о методологии моделирования экспериментальных химиолучевых оральных мукозитов носят разрозненный характер. Существующие экспериментальные модели оральных мукозитов выполнены при системном воздействии на экспериментальных животных цитостатика бусульфана и локальном воздействии - инфракрасное точечное облучение слизистой языка с последующим образованием эрозий и язв [268, 276]. Необходимо отметить, что данный метод не в полной мере патофизиологически адекватен оральному мукозиту, индуцированному воздействием поражающих факторов химиолучевой терапии.

Одним из методов лечения химиолучевых оральных мукозитов является антимикробная терапия. По мнению некоторых исследователей [79, 334] без непосредственной коррекции уровня патогенной грибковой микрофлоры СОПР невозможно достигнуть успешных результатов в лечении оральных мукозитов (стоматитов). На сегодняшний день представлен большой арсенал средств, предназначенных для обработки слизистой: мощные антисептики и антибиотики. В то же время, по данным ряда авторов, применение антибактериальных средств оказалось не достаточно эффективным в профилактике и лечении орального мукозита [308, 189]. Ведущими факторами, обуславливающими неудачи при проведении традиционного лечения оральных мукозитов, являются устойчивость микроорганизмов к действию антибиотиков и развитие при воздействии на организм повреждающих факторов химической и радиационной природы иммунодефицитных состояний.

В настоящее время получены убедительные данные о важной роли иммунных нарушений в патогенезе химиолучевого орального мукозита (стоматита) [124]. Характер изменений в иммунной системе у онкобольных, получавших химиолучевую терапию рака ОФО разнообразен. Одни авторы указывают на вторичный иммунодефицит, на фоне которого прогрессирует лучевой стоматит [308], другие - на нарушение клеточного звена иммунитета [60], третьи делают акцент на изменениях гуморального звена [124].

Исследованиями последних лет установлено, что патогенные микроорганизмы полости рта играют важную роль в развитии орального химиолучевого мукозита; при этом особое значение в патогенезе данного осложнения отводят грибковой микрофлоре [98, 273, 274, 288]. В связи с этим для профилактики и лечения орального мукозита применяют антисептики, антибиотики и противогрибковые препараты, но полученные результаты носят достаточно противоречивый характер [320, 98]. По мнению [308] в условиях постлучевой иммунодепрессии, даже самая современная противомикробная антибиотикотерапия не всегда может дать желаемого эффекта в коррекции лучевого орального мукозита.

Патофизиологической основой нарушений нормального состава микрофлоры является, главным образом, развитие иммунной дисфункции и, прежде всего, функциональной дезорганизацией фагоцитов [60, 146]. Особое место среди факторов иммунитета, опосредованного активацией фагоцитов, занимают антимикробные пептиды, являющиеся, с одной стороны, естественными эндогенными антибиотиками, а с другой - сигнальными молекулами, вовлечёнными в процессы активации клеток иммунной системы и репарации тканей [341, 322, 261]. В связи с этим, определенный интерес вызывает возможность применения для лечения воспалительных процессов, в том числе химиолучевых оральных мукозитов, препаратов

иммунорегуляторных пептидов (цитокинов, факторов роста и др.), которые благодаря широкому спектру биологической активности могут оказывать определенное влияние на течение воспалительного процесса [252, 256].

Выходом из сложившейся ситуации могут стать принципиально новые пути воздействия на воспалительный процесс в СОПР, и одним из таковых является активация эффекторов врожденного иммунитета. Для этого, по- нашему мнению, необходимым является применение индукторов антимикробных пептидов, индукторов интерферонов и редокс-регуляторов, обеспечивающих нормализацию микробиоценоза, достижение необходимого баланса цитокиновой системы (про- и противовоспалительных регуляторных пептидов). Вышеперечисленным требованиям, по нашему мнению, в полной мере отвечают препараты, содержащие дисульфиды глутатиона.

В этой связи одной из задач выполненных исследований, результаты которых представлены в настоящей работе, явилось изучение состояние микробиоценоза на слизистой полости рта и содержание катионных антимикробных пептидов а-дефензина HNP 1-3 , кателицидина LL-37 и P- дефензина hBD-3 в крови экспериментальных животных, подвергшихся комбинированному химиолучевому воздействию, а также исследование возможности коррекции выявленных нарушений с помощью дисульфидов глутатиона Na₂GSSG (глутоксим) и органической соли дисульфида глутатиона и инозина Na^SSG-инозин (моликсан).

Установлено, что развитие экспериментального мукозита при воздействии изолированного у-облучения или комбинированного химиолучевого воздействия сопровождалось значительным повышением уровня микробной обсемененности СОПР. На 15 сут после облучения крыс в дозе 10 Гр количество колоний Р-гемолитического стрептококка, негемолитического стрептококка и стафилококка возросло в среднем в 2-2,5 раза по сравнению с группой «интактные животные». Еще более выраженные изменения выявлены в уровне микробной обсемененности слизистой оболочки полости рта экспериментальных животных энтеробактериями (в 3,5 раза), анаэробами (в 3,4 раза) и кандидами (в среднем в 3 раза) по сравнению с контрольными крысами. В период разгара химиолучевого орального мукозита (15 сут после комбинированного химиолучевого воздействия) количество колоний негемолитического стрептококка, стафилококка, энтеробактерий возросло по сравнению с группой «интактных животных» более чем в 3-4 раза.

Применение органической соли дисульфида глутатиона и инозина в качестве средства лечения химиолучевого мукозита способствовало восстановлению микробиоценоза в ротовой полости животных. На фоне лечения препаратом Na^SSG-инозин более, чем в 40% случаев не выявлен существенный рост изучаемых микроорганизмов в том числе и кандид по сравнению с группой облученного в дозе 10 Гр контроля. В остальных 60% случаях определялось замедление роста микрофлоры, снижение количества определяемых микроорганизмов в среднем на 2 порядка.

Обращает на себя внимание, что проведенная терапия препаратом

Na^SSG-инозин (моликсан) не обладала явной избирательностью действия по отношению к тому или иному виду микроорганизмов. Наибольшая противомикробная активность препарата Na2GSSG-инозин была отмечена по отношению энтеробактерий (высевались только в 50% случаев) и негемолитического стрептококка (40% случаев). Следует обратить внимание на возможное антимикотическое действие применяемого препарата: грибы рода Candida были выделены в 90-100% случаев на 15 сут после химиолучевого воздействия (на фоне химиолучевого мукозита); после лечения препаратом Na2GSSG-инозин этот показатель снизился до 30%.

В опытах in vitro установлено, что Na2GSSG-инозин (моликсан) обладал низкой антимикробной активностью (лишь в концентрациях от 400 мкг/мл и выше) в отношении стафилококков, эшерихий и сальмонелл. Следует отметить, что у наиболее эффективных антибиотиков выраженный антимикробный эффект регистрируется при использовании их в концентрации 1 мкг/мл и ниже [115].

Для выяснения возможных механизмов противомикробной и противомикозной активности препарата Na2GSSG-инозин в наших исследованиях было изучено состояние эффекторов врожденного

иммунитета при поражении слизистой оболочки полости рта

неблагоприятными факторами химической и физической природы, а также оценена возможность регуляции экспрессии антимикробных пептидов (АМП) с помощью данного лекарственного средства.

Врожденный иммунитет обеспечивает немедленный вид защиты практически у всех живых организмов. Основу врожденного иммунного ответа составляют многофункциональные АМП, как эволюционное усовершенствование для предотвращения микробного заражения и повреждения тканей [62, 145, 222, 263]. В большинстве случаев

первоначальное взаимодействие патогенного микроорганизма с макроорганизмом происходит на поверхности кожи или на выстилающем эпителии дыхательного, желудочно-кишечного, репродуктивного или мочевыделительного трактов [154, 226, 227, 312]. Эпителиальные клетки позвоночных продуцируют АМП, в качестве составных элементов первой линии защиты. Поврежденная кожа или слизистая оболочка могут быть основными входными воротами инфекции и создавать условия для размножения и распространения патогенных микроорганизмов. Изначальный каскад реакций врожденного иммунитета, который включает в себя продуцирование АМП воспалительными клетками, такими как нейтрофилы, тканевые фагоциты, и в том числе, макрофаги, является частью ответа на воспалительный процесс [141, 198, 211, 292].

АМП успешно сохраняли свою антимикробную активность на протяжении миллионов лет, некоторые действуют, как природные антибиотики, демонстрируя необычайно широкий спектр активности, от грамположительных и грамм-отрицательных бактерий до грибов и вирусов [187, 194, 195, 305, 306, 343]. АМП участвуют в воспалительном ответе, действуя в качестве хемоаттрактантов для иммунных клеток, включая рекрутинг нейтрофилов путем индуцирования выработки IL-8 и мобилизации имунокомпетентных T-клеток, а также агентов, усиливающих клеточную адгезию и последующую трансэпителиальную миграцию клеток [198]. Благодаря их ЛПС и ЛТК-связывающей способности, некоторые АМП действуют при сепсисе как противовоспалительные соединения [284, 292]. Помимо функционирования в качестве хемокинов и привлечения мигрирующих и циркуляторных клетки, АМП ускоряют заживление ран через активацию ангиогенеза и эпителиального роста [164, 165, 233, 343].

В зависимости от молекулярного строения, конформационной структуры или преобладающей аминокислоты, АМП делят на четыре основных класса: линейные а-спиральные структуры без дисульфидных связей (кателицидины), молекулы со структурой P-листа, которая стабилизируется за счет свойственных ей дисульфидных связей (а- и P- дефензины), с преобладанием одной и более аминокислот с высоким содержанием аргинина, глицина, гистидина, пралина, триптофана или их отдельных комбинаций (индолицидин) и петлевидные пептиды с одной дисульфидной связью (бактенецин) [194, 226, 344]. Наиболее изучены два основных класса АМП человека - дефензины и кателицидины.

Дефензины составляют большое семейство низкомолекулярных (4 кД), богатых цистеином катионных пептидов, которые способны к уничтожению широкого спектра патогенов, включающих разнообразные бактерии, грибы и оболочечные вирусы. Наиболее широко распространены а- и в-дефензины [145, 187, 343]. Кателицидин hCAP-18, обладающий а-спиральным

строением, известный также как LL-37, является единственным изученным антимикробным пептидом из семейства кателицидинов [284, 342].

Кателицидины, как правило, экспрессируются миелоидными клетками- предшественниками, но также известно, что у некоторых видов они экспрессируются в зрелых циркулирующих нейтрофилах и лимфоидной ткани новорожденных [342]. Помимо противомикробной активности, LL-37, предположительно, участвует в различных биологических процессах, таких как ангиогенез, хемотаксис, выработка цитокинов, высвобождение гистамина и заживление ран [204, 205, 211, 226, 285, 289, 305].

АМП могут экспрессироваться конститутивно (постоянно) или индуцироваться в ответ на специфический стрессорный фактор, такой как инфекция или воспаление [167, 200, 292, 335]. Дефензинам-а более свойственна конститутивная (постоянная) экспрессия, а выработка в- дефензинов чаще индуцируется [195, 284]. Кроме того, было установлено, что а-дефензины в основном действуют внутри фагосом, тогда как в- дефензины синтезируются эпителиальными клетками [145]. Помимо способности АМП к нейтрализации эндотоксинов, кателицидины оказывают прямое воздействие и снижают выработку TNF-а [148]. Внеклеточное выделение некоторых типов дефензинов приводит к выработке неактивных

АМП, однако одновременная выработка кателицидина обеспечивает активную функциональную синергию АМП [150].

Дефензины вызывают индукцию синтеза цитокинов, участвуют в регуляции генов множества цитокинов и хемокиновых рецепторов. Так, обработка культуры эпителиальных клеток бронхов человека HNP-1 дозозависимо приводит к увеличению экспрессий мРНК, IL-8 и IL -1р, к увеличению секреции IL-8 и увеличивает NF-кВ ДНК-связываюшую активность [278, 266]. HNP стимулирует продукцию ФНО-а и IL-1P моноцитами, а также синтез IL-2, IL-6, IL-10, IL-8 [322].

Действие дефензинов не ограничивается только противомикробными свойствами. Дефензины-а (HNP) регулируют активацию экспрессии и секреции Т-лимфоцитов, вызывают мобилизацию внутриклеточного Ca²+. Дефензины-Р (hBD) увеличивают миграцию и пролиферацию кератиноцитов (за счет индукции фосфорилирования EGFR, STAT1 и STAT3). Ингибирование hBD в значительной степени снижает миграцию и пролиферацию кератиноцитов. Таким образом, дефензины вовлечены в иммунную зашиту кожи и слизистой посредством стимулирования продукции цитокинов и хемокинов и участия в ранозаживлении, обеспечивая миграцию и пролиферацию кератиноцитов [171, 259, 261, 336].

Дефензины-а в полости рта здоровых людей обнаружены в запирающем эпителии и в десневой жидкости [161]. Р-дефензины (HBD 1-3), присутствуют в нормальном и ороговевающем эпителии СОПР. Небольшое содержание HBD-3 найдено, главным образом, в клетках базального слоя и в клетках Лангерганса; во время воспаления этот дефензин может быть также выявлен в более поверхностном слое эпителия [166]. Основной уровень дефензина HBD-2 в оральном эпителии относительно низкий, но увеличивается быстро в присутствии цитокинов (TNF-а и IL-1Р), бактерий (Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis) и грибов (Candida albicans) [161, 162, 338]. При воспалительных заболеваниях ротовой полости продукция дефензина-а HNP1-3 адаптивно увеличивается в ответ на различные инфекции и на острое повреждение эпителиальных барьеров. В то же время, увеличенная продукция может быть ассоциирована с хроническими воспалительными процессами, что отражает двойственность функционирования HNP1-3 в иммунной активации и связано с процессами дизрегуляции.

Дефензины-а и в были также обнаружены в слюнных железах и в слюне, хотя концентрации дефензинов HBD-1 и 2 типов в слюне может значительно отличаться у здоровых людей [172, 161]. Активация слюнных дефензинов - один из механизмов защиты слизистой оболочки полости рта от инфекции; изменение их уровня в слюнной жидкости может служить индикатором продолжающегося воспаления или инфекции в полости рта [127]. Антибактериальная активность, главным образом против аэробных бактерий, характерная особенность в-дефензинов [160]. Показано, что уровень в-дефензина значительно повышается в присутствии основных видов бактерий, участвующих в развитии периодонтита: Porphyromonas gingivalis и Fusobacterium nucleatum [172, 338, 128].

Индукция синтеза в-дефензинов (HBD) происходит несколькими способами, наиболее вероятно через MAP-киназы (активированный митогеном белок киназы) или NF-кВ (ядерный фактор кВ) [218, 282, 145]. Дефензины-в восприимчивы к деградации и инактивации цистеиновыми протеазами катепсинами В, L и S, что несомненно важно для регуляции уровня в-дефензинов в организме: при увеличенной экспрессии катепсинов усиливается деградация hBD-2, -3 [311], что в свою очередь способствует росту бактериальной инфекции и колонизации микроорганизмов. J. Bissell et al. показали, что повышение уровня в-дефензина HBD 1-3 происходит в ответ на воспалительные процессы в периодонтальной ткани [143]. Изменение уровня в-дефензинов, кажется, очень динамичный и переменный процесс, который зависит от продолжительности периодонтита, состава зубного налета и присутствия провоспалительных цитокинов [190]. J. Hofman et al. наблюдали значительное увеличение концентрации а-дефензина (HNP 1-3) в слюне 25 пациентов с хроническим периодонтитом по сравнению со здоровыми людьми [201]. Показано также, что дефензины препятствуют развитию патогенных микроорганизмов вирусной природы, включая герпес (HSV-1 и HSV-2), CMV, HPV и ВИЧ [258, 160, 129]. Уровень HBD-2 и 3 в оральном эпителии был увеличен в присутствие ВИЧ [160, 166].

Грибковое заражение разновидностями Candida также влияет на содержание дефензинов в поврежденных тканях полости рта. Механизм противогрибковой активности дефензинов остается до конца не изученным до сих пор; так же как и антибактериальные свойства, эффективность действия которых может отличаться и зависеть от окружающих условий, которые включают, например, концентрация Ca²+, Mg²+ ионы и соли [329].

По мнению Z. Feng et al. [179] дефензины предотвращают (адгезию) прилипание клеток грибов к эпителию СОПР за счет повреждения грибковой клеточной мембраны. Их содержание значительно увеличивается после контакта с патогенными гифами мицелий. При иммуногистохимическом анализе биоптатов СОПР, полученных от пациентов с оральным кандидозом, Sawaki et al. [279] наблюдали значительное увеличение количества HBD-2 в патологически измененных тканях, в сравнении со здоровыми областями [172, 173]. Чувствительность грибов к дефензинам зависит от определенного периода развития кандид [129]. Трансформация грибов от бластспоровой в гифы, кажется, играет важную роль в модификации уровня дефензинов. В условиях гифового прогресса уровень HBD-2 уменьшается [128], а- дефензины также участвуют в противогрибковом ответе. В биоптатах СОПР, полученных от пациентов с хроническим гиперпластичным кандидозом, наблюдали высокую концентрацию HNP-1 а-дефензина [136]. Особенно высокая концентрация HNP-I -контактирующих нейтрофилов была найдена в сильно зараженных участках ткани, где нейтрофилы сформировали подобные

микровоспалению группы. При этом а-дефензины создают защитный барьер в поверхностных слоях эпителия, который предотвращает патогенное проникновение в глубже лежащие ткани.

Увеличение уровня некоторых дефензинов было также обнаружено при воспалительных заболеваниях полости рта, не связанных с инфекцией. Воспалительные процессы могли быть обусловлены ростом провоспалительных цитокинов и их индуктивным эффектом на уровень дефензинов. Установлено, что TNF-а стимулирует синтез гена HBD-2, в то время как INF-y способствует синтезу HBD-3 [260]. В иммуногистохимических исследованиях биоптатов СОПР, полученных от пациентов с красным плоским лишаем, наблюдалась высокая концентрация HBD-2 [129]. Увеличенное содержание HBD-3 было также обнаружено при плоском лишае и лейкоплакии [260]. Увеличение уровня HBD-3 при лейкоплакии было описано M. Wenghoefer et al. [332], которые наблюдали значительное уменьшение содержания HBD-1 и HBD-2 в СОПР больных по сравнению с экземплярами слизистой оболочки от здоровых пациентов.

Малигнизация опухолей ротовой полости очень часто сопровождаются провоцирующей реакцией, которая, согласно Y. Abiko et al. [129], может дополнительно стимулировать синтез HBD-2. Результаты опытов in vitro на клеточных линиях, полученных из чешуйчатой оральной карциномы клетки (OSCC), подтвердили, что содержание HBD-2 было связано с уровнем эпителиального ороговения и увеличения в большем количестве ороговевающих тканей [128,129]. Между тем, S. Joly et al. [216] описали значительное снижение уровня HBD-1 и содержания HBD-2 в клеточных линиях сквамозной карциномы ротовой полости, вместе с угнетением ответа на стимулирование такими факторами, как TNF-а, IFN-y и IL-ір, по сравнению с нормальной тканью. Значительное снижение содержания HBD-1 в клетках сквамозной карциномы было выявлена M. Wenghoefer et al. [332].

Все это может указывать на роль этого дефензина в злокачественном перерождении [129].

Возрастающая бактериальная антибиотикорезистентность требует поиска новых, более эффективных антибактериальных агентов. Клиническое исследование при разработке лекарств, основанных на синтетическом продукте антибактериальных пептидов или модуляция их уровня, уже начаты во всем мире [172, 260, 239, 228]. Потенциально, из-за их мультинаправленного антибактериального эффекта и свойства иммуномодулирования, АМП, в частности дефензин может использоваться в лечении многих инфекций и воспалительных заболеваний. Y. Abiko et al. [129] предлагают использование Р-дефензин-базовых агентов в лечении эрозивно-язвенных оральных нарушений, включая пузырчатку, язвенных стоматитов различного генеза. Модификация экспрессии гена дефензина может также влиять на риск злокачественного перерождения при предопухолевых заболеваниях [199].

Однако, несмотря на мультинаправленные, мультисосредоточенные исследования, роль дефензинов в состоянии здоровья и болезни все еще остается не изученной. Их антибактериальный эффект и свойства иммуномодуляции вызывают большой интерес и создают потенциальные возможности для использования в лечении инфекционных и воспалительных процессов, возникающих в условиях химиолучевого орального мукозита.

В ходе проведенных нами исследований установлено, что в условиях комбинированного (химиолучевого) воздействия концентрация а-дефензина уменьшилась в крови животных группы «цисплатин+облучение» в среднем в 1,8 раза по сравнению с группой «интактные животные», а кателицидина LL- 37 - почти вдвое в крови крыс по сравнению с группой интактных животных. Изменение количества Р-дефензина hBD-3 в крови крыс носило противоположный характер: его содержание (на пике развития орального химиолучевого мукозита) достигло величин, превышающих уровень интактных животных в среднем на 70%.

Для выяснения причины разнонаправленной динамики уровня изученных а-дефензина (HNP 1-3) и Р-дефензина (hBD-3) в плазме крови экспериментальных животных с химиолучевым мукозитом необходимо напомнить, что а-дефензины в основном продуцируются внутри фагосом, а Р-дефензины экспрессируются эпителиальными клетками [145].

Установлено также, что комбинированное химиолучевое воздействие на организм сопровождалось угнетением костномозгового кроветворения у экспериментальных животных, что привело к существенному снижению в периферической крови пула нейтрофилов и, соответственно, к уменьшению уровня секретируемых ими а-дефензина HNP 1-3 и кателицидина LL-37. Полученные данные согласуются с данными литературы [195] о конститутивном характере их экспрессии. Что же касается Р-дефензина (hBD-3), то рост его содержания, можно объяснить следующими фактами: во-первых, синтез данного пептида осуществляется в основном эпителиальными клетками [200, 261], во-вторых, его экспрессия

индуцируется специфическими стрессорными факторами, такими как инфекция или воспаление [164, 198, 312].

Анализ полученных данных позволяет полагать, что одной из основных причин развития химиолучевых нарушений микробиоценоза в полости рта экспериментальных животных является снижение микробицидной активности антимикробных пептидов. Этот процесс нельзя рассматривать в отрыве от активации избыточной пероксидации липидов в СОПР. Избыточная активация свободно-радикальных процессов, по-видимому, сопровождается восстановительными процессами, а, следовательно, разрывами дисульфидных связей в структуре ингибиторов цистеиновых протеиназ - катепсинов B, C и L, что приводит к стимуляции их активности [59, 241, 293, 340]. Такого рода сдвиги в системе «ингибиторы протеолиза - катепсины - антимикробные пептиды» могут приводить к уменьшению количества дефензинов в плазме крови животных, подвергнутых химиолучевому воздействию [222].

Следует напомнить, что дефензины-Р восприимчивы к деградации и инактивации цистеиновыми протеазами катепсинами В, L и S, что несомненно важно для регуляции уровня Р-дефензинов в организме. При увеличенной экспрессии катепсинов усиливается деградация hBD-2, -3 [311, 312, 261], что в свою очередь способствует росту бактериальной инфекции и колонизации микроорганизмов. В условиях химиолучевого воздействия на экспериментальных животных у-квантами и активными формами кислорода разрушаются дисульфидные связи ингибиторов катепсинов В, L и S и нарушается их структурно-функциональная целостность. При этом снижается избыточная (вызванная опухолевым процессом) экспрессия цистеиновых протеаз и тем самым происходит компенсаторное умеренное повышение количества Р-дефензинов [213, 293, 311]. Восстановление с помощью моликсана дисульфидных связей и структурно-функциональной целостности цистеиновых катепсинов сопровождается нормализацией количества изучаемых антимикробных пептидов. Кроме того, некоторые АМП, помимо функционирования в качестве хемокинов и привлечения мигрирующих и циркуляторных клеток, ускоряют заживление ран через ангиогенез и эпителиальный рост [141, 210, 211].

Показано, что комбинированное химиолучевое воздействие животных вызывает инактивацию внеклеточно секретируемых а-дефензинов [150]. По- видимому это обусловлено химиолучевым угнетением ингибиторов протеаз с последующим разрывом дисульфидных связей в структуре а-дефензинов и снижением тем самым их количества. В этой связи возникает предположение о возможности применения лекарственных средств для восстановления функционально активной конформации активности АМП. Такими средствами могут быть препараты, содержащие дисульфиды глутатиона.

Восстановление с помощью дисульфида глутатиона Na^SSG-инозин микробиоценоза, в частности, снижение выраженности кандидоза слизистой оболочки полости рта, во многом определяется уровнем sIgA, что связано с агрегацией кандид и подавлением их адгезии на эпителиоцитах. Следует отметить, что кандиды способны противостоять действию sIgA, поскольку повышение титра антифунгальных антител в ротовой жидкости при развитии кандидоза не лимитирует инфекцию. Так, некоторые штаммы C. albicans и C. glabrata продуцируют IgA-протеиназы, разрушающие IgA_l, IgA₂ и slgA за счет расщепления в их структуре дисульфидных мостиков и изменения тем структурно-функциональной конформации иммуноглобулинов. Однако, в литературе отсутствуют сведения о влиянии химиолучевых повреждающих факторов на структурно-функциональную целостность дефензинов и иммуноглобулинов А, в частности, sIgA.

Следует напомнить, что препарат Na^SSG-инозин (моликсан) является органической солью дисульфида глутатиона и инозина, содержащей в своей структуре пептидную и нуклеозидную компоненты [84]. Пептидная составляющая представляет собой фармакологический аналог окисленного глутатиона, содержащего дисульфидные связи. Применение Na₂GSSG- инозин способствует, по-видимому, восстановлению функционально активной конформации вышеперечисленных иммуноглобулинов IgA, и slgA и дефензинов (а-дефензина HNP 1-3 и Р-дефензина hBD-3) за счет восстановления дисульфидных мостиков в их структуре и нормализации тем самым их функциональной активности [222]. Это в свою очередь приводило к существенному снижению количества кандид с 5,4±0,2 до 1,8±0,1 на слизистой ротовой полости экспериментальных животных.

Выявленная положительная динамика уровня кателицидина LL37 (hCAP18), Р-дефензина (hBD-3), дефензина-а (HNP 1-3) и микробной обсемененности слизистой полости рта крыс, подвергшихся комбинированному химиолучевому воздействию и получавших лечение препаратом Na^SSG-инозин может свидетельствовать как о важной роли нарушений микробиоценоза полости рта в развитии орального мукозита, так и о возможности индукции антимикробных пептидов с помощью препаратов, в состав которых включен дисульфид глутатиона (окисленный глутатион или его фармакологический аналог глутоксим).

Показано, что определенную роль в развитии рака слизистой оболочки полости рта (орофарингеальной области) играет герпесвирусная инфекция, в частности, вирусы простого герпеса, цитомегаловирусы и вирусы Эпштейна- Барра [151]. Выполненные нами экспериментальные исследования показали, что у зараженных вирусом герпеса простого 1 типа (HSV-1) животных на фоне введения цисплатина и последующего облучения развилась яркая клиническая картина орофарингеального синдрома. Так, явления орального мукозита у экспериментальных животных проявлялись уже через 1 сут после радиационного воздействия. Около 80% животных были малоподвижны и отказывались от приема пищи. При осмотре полости рта отмечалась диффузная гиперемия зубодесневого края у резцов нижней челюсти и дна полости рта. На 3 сут выраженное угнетение двигательной активности и пищевой возбудимости наблюдалось у 100% крыс. В этот же период у 100% особей на слизистой оболочке полости рта образовались петехии, а у 80% - глубокие эрозии и язвы. К 5 сут выраженные явления орального мукозита в виде эрозий и язв были выявлены у 100% экспериментальных животных. До 15 сут наблюдения, явления деэпителизации нарастали, проявлялись в виде сливного эпителиита и язвенно-некротического мукозита. Развитие химиолучевого орального мукозита III-IV степени привело к гибели 40% крыс. У остальных животных клинические проявления сохранялись вплоть до 30 сут, после чего наступило некоторое улучшение общего состояния, нормализовалась пищевая возбудимость и двигательная активность.

Обращает на себя внимание тот факт, что предварительное инфицирование экспериментальных животных HSV-1 утяжеляло течение химиолучевого орального мукозита, что может свидетельствовать о значимой роли герпесвирусной инфекции в формировании и клинических проявлениях орального мукозита.

Применение препарата Na^SSG-инозин способствовало 2-3-кратному снижению частоты развития и тяжести течения ОФС у животных, подвергнутых комбинированному химиолучевому воздействию на фоне герпесвирусного инфицирования. Клиническая картина орального мукозита в виде эрозивно-язвенного поражения СОПР встречалась у животных опытной группы в 3-4 раза реже, чем в контроле. Подобная динамика сохранялась на протяжении всего периода наблюдения. Следует также отметить, что лечебно-профилактическое введение Na^SSG-инозина уменьшало

выраженность клинических проявлений ОФС и способствовало сохранению жизни всем животным опытной группы при 40% гибели в контроле.

На основании анализа полученных результатов можно заключить, что дополнительная герпесвирусная нагрузка к повреждающему действию химиолучевых факторов усиливает промукозитное действие последних. Использование в разработанных моделях экспериментального орального мукозита дополнительной герпесвирусной нагрузки позволяет ответить на поставленный вопрос о роли герпесвирусной инфекции в развитии и тяжести течения лучевого ОФС. Кроме того, разработанная модель также может быть использована при оценке фармакологической активности средств профилактики и лечения осложнений химиолучевой терапии. Следует отметить, что разработанные нами модели экспериментальных лучевых и химиолучевых мукозитов наиболее полно отражают симптоматику орофарингеального синдрома, возникающего у онкологических больных при химиолучевой терапии рака ОФО [276, 325]. При этом моделирование химиолучевого мукозита с дополнительным воздействием герпесвирусной инфекции к настоящему времени в литературе не описано.

Известно, что целостность эпителия слизистой оболочки полости рта при воздействии механических, химических и физических (лучевых) раздражителей, во многом, определяется состоянием систем пролиферации и дифференцировки эпителиальных клеток, которые находятся под регуляторным контролем ростовых факторов, таких как эпидермальный фактор роста (EGF) и интерлейкины [83]. Учитывая, что в литературе практически отсутствуют сведения о динамике уровня эпидермального фактора роста при воздействии химиолучевой терапии, одной из задач настоящего исследования явилось изучение химиолучевого влияния на содержание в крови эпидермального фактора роста (EGF), а также про- и противовоспалительных цитокинов IL-ip и IL-4.

В настоящее время большинство исследователей сходятся во мнении, что одними из наиболее эффективных средств, позволяющих добиться восстановления клеточности всего костного мозга или отдельных его ростков в условиях радиационного воздействия, являются цитокины [58, 101]. К таким соединениям в первую очередь могут быть отнесены колониестимулирующие факторы: ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ. Однако развитие постлучевой гемодепрессии нельзя объяснить только снижением уровня цитокинов в связи с массовой гибелью лимфоцитов [34, 35, 110,]. Более того, после облучения выявляется увеличение секреции цитокинов макрофагами и моноцитами и кратковременное повышение их уровня в периферической крови [224]. Возникающая при этом постлучевая гемодепрессия, по-видимому, обусловлена не только массовой гибелью кроветворных клеток, но и десенситизацией соответствующих рецепторов к лигандам-гемопоэтическим факторам [11, 158, 192].

В ходе проведенных нами исследований было установлено, что химиолучевое воздействие на животных контрольной группы сопровождалось дозозависимым увеличением в крови содержания EGF и IL- 1Р в 1,6 и 2 раза, соответственно. Уровень противовоспалительного цитокина IL-4 повысился в этот период лишь на 30%. Казалось бы, повышение уровня регуляторных пептидов (эпидермального фактора роста и IL-1P) в крови животных, подвергшихся химиолучевому воздействию, является благом для организма и может свидетельствовать об активации репаративных процессов. Однако клинические наблюдения свидетельствуют об обратном: параллельно с ростом в крови животных концентрации исследуемых цитокинов возрастала тяжесть течения химиолучевых оральных мукозитов (стоматитов) с преобладанием эрозивно-язвенных процессов.

Применение в качестве средства лечения химиолучевых оральных мукозитов органической соли дисульфида глутатиона и инозина значительно уменьшало частоту и тяжесть их клинических проявлений и способствовало нормализации концентрации изучаемых пептидов. Какова же причина выявленных нами столь ярких противоречий между повышением уровня EGF и нарушением репаративных процессов в СОПР?

Для ответа на поставленный вопрос необходимо обратить внимание на состояние рецепторов к эндогенным лигандам и в первую очередь на активность рецептора эпидермального фактора роста, так как, согласно данным литературы, биологическая активность многих эндогенных цитокинов определяется рецепцией эпидермального фактора роста [83].

В опытах in vitro на клеточной культуре А 431 эпидермоидной карциномы установлено, что Na^SSG-инозин (моликсан) оказывал активирующее воздействие на рецептор эпидермального фактора роста (EGF), которое выражалось в многократном повышении уровня фосфорилирования этого рецептора. Наблюдалось две волны активации: первая на ранних сроках воздействия препарата на клетку (через несколько минут), а вторая - через 8 ч инкубации. Аналогичный волнообразный характер выявлен и в стимуляции изучаемым препаратом митоген- активирующих киназ ERK1,2 (МАР-киназ ERK1,2) в клетках А431: активация через 5-10 мин; далее снижение величины показателя до уровня нормы и появление второй волны через 8 ч после воздействия. Максимальная (до 29 раз) степень активации препаратом Na^SSG-инозин МАР-киназ

ERK1,2 выявлена при длительных (в течение 8 ч) сроках инкубации клеток. В опытах продемонстрировано совпадение динамики фосфорилирования рецептора EGF и МАР-киназ ERK1,2 при действии изучаемого соединения.

Можно сделать вывод, что препарат моликсан, содержащий дисульфид глутатиона, устранял десенситизацию рецептора EGFR, восстанавливал структурно-функциональную его целостность, что приводило к активации процессов фосфорилирования сигнал-передающих белков, в частности, митоген-активируемых протеинкиназ (МАР-киназ рERK1) [157].

По существующим представлениям, эффективность лечебных мероприятий при остром лучевом поражении в значительной степени определяется их способностью активировать процессы пролиферации и дифференцировки клеток костного мозга и ослаблять тем самым выраженность гемодепрессии [37]. Лечебное применение Na^SSG-инозин способствовало устранению пострадиационного блока митоза гемопоэтических клеток костного мозга: интенсивность включения Н- тимидина в ДНК клеток костного мозга к 3 сут возросла по сравнению с уровнем облученного контроля почти в 3 раза, а к 12 сут наблюдения - более чем в 2 раза по сравнению с контролем. Проведенные эксперименты показали, что Na^SSG-инозин оказывает стимулирующее влияние на рост числа эндогенных селезеночных колоний и интенсивность биосинтеза ДНК в клетках костного мозга облученных в сублетальной дозе животных, что свидетельствует об активации процессов пролиферации и дифференцировки.

Таким образом, в экспериментальной части диссертационного исследования была патогенетически обоснована возможность профилактики и лечения химиолучевых мукозитов с помощью фармакологических препаратов, содержащих дисульфиды глутатиона. Дано патофизиологическое обоснование эффективности дисульфида глутатионсодержащего препарата моликсан, как миметика антимикробных пептидов и индуктора интерферона, в качестве средства лечения и профилактики химиолучевых оральных мукозитов, экспериментально обоснована и рекомендована доза и схема применения у больных раком ротоглотки. Доказано, что применение препарата Na^SSG-инозин (моликсан) позволяет предупреждать и/или ослаблять нежелательные явления химиолучевой терапии - оральные химиолучевые мукозиты и гемодепрессию, а также повышать эффективность основного противоопухолевого лечения при сохранении высокого качества жизни больных раком орофарингеальной области.

Клинические наблюдения полностью подтвердили представление об эффективности дисульфидов глутатиона в качестве средств профилактики и лечения орального мукозита у онкологических больных. По сравнению с пациентами, у которых противовоспалительная терапия проводилась традиционными методами, у больных, в схему лечения которых включали курсовое применение препарата Na^SSG-инозин, практически

отсутствовали или были не столь выраженными такие субъективные симптомы химиолучевого орального мукозита как боль при глотании, изменение вкуса и повышенная нервная возбудимость. Отчетливо снижалась частота сливных эпителиитов, не выявлены случаи возникновения эрозий, язв и некротических повреждений слизистой полости рта.

Наиболее ранние проявления осложнений химиолучевой терапии в виде мукозита слизистой оболочки полости рта I-II степени тяжести были выявлены более чем у 65% пациентов контрольной группы после облучения в дозе 20 Гр. При достижении суммарной очаговой дозы (СОД) облучения орофарингеальной области в 40 Гр на фоне применения цисплатина практически у 100% больных развивался оральный мукозит, в основном III- IV (в 69,2% случаев), значительно реже I-II (у 30,2% больных) степени тяжести. Появление этого осложнения потребовало перерыва в проведении химиолучевой терапии (ХЛТ) в среднем на 12-14 дней у 14 из 39 пациентов контрольной группы.

Введение Na^SSG-инозин больным с раком ОФО внутримышечно в дозе 60 мг через день после очередной фракции облучения позволило снизить тяжесть орального мукозита (с III-IV степени до I-II степени) и провести запланированное химиолучевое лечение в полном объеме. У больных основной группы клинические проявления химиолучевого орального мукозита III-IV степени наблюдались лишь в 15,6% случаев при 69,2% в контрольной. Обращает на себя внимание тот факт, что потребность в прерывании ХЛТ у пациентов основной группы не возникала.

По-видимому, применение Na^SSG-инозин способствует отмене десенситизации и восстановлению чувствительности рецепторов к регуляторным пептидам, в частности, к эпидермальному фактору роста (EGF) и колониестимулирующим факторам. Включение каскада биохимических реакций по активации сигнал передающих белков, таких как митоген-активируемых и экстраклеточно регулируемых протеинкиназ (МАР- киназ ERK 1,2) реализуется стимуляцией транскрипционных белков c последующей активацией процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток. Окисленный глутатион, входящий в структуру Na^SSG-инозин, по отношению к рецепторам, функционально активная конформация которых требует дисульфидной сшивки в структуре молекулы, выступает как парциальный агонист, активирующий рецептор [312, 217]. В работах G. Filomeni [182, 183, 184] и Е. Буровой и др. [13, 14] показана способность окисленного глутатиона оказывать рецептор опосредованное влияние на различные клетки, что подтверждает полученные нами данные в отношении органической соли дисульфида глутатиона и инозина (моликсан).

Секреция окисленного глутатиона (GSSG) во внеклеточное пространство, как впрочем, и восстановленного (GSH), осуществляется практически всеми клетками организма и является АТФ-зависимым процессом, который нарушается в клетках облученного организма. Особенностью транспорта GSSG из клетки является то, что он зависим и от количества конъюгат глутатиона [312], содержание которых может существенно возрастать в радиочувствительных тканях при химиолучевом воздействии, что, вероятно, приводит к ингибированию процессов транспорта вышеперечисленных метаболитов. Дисбаланс между уровнем восстановленного и окисленного глутатионов GSH/GSSG в клетках, подвергшихся воздействию повреждающих факторов химической и физической (в том числе и ионизирующих излучений) природы, приводит к изменению соотношения этих соединений вне клеток, как в микроокружении поврежденных клеток, так и в организме в целом [159]. Следствием подобной деформации обмена окисленного глутатиона явится сниженное его поступление во внеклеточное пространство в первую очередь из пораженных клеток и, частично, из нормальных клеток. Такого рода сдвиги в обмене окисленного глутатиона сопровождаются усиленным насыщением внеклеточного пространства восстановленного его аналога. Поступление восстановленного глутатиона из внутриклеточного пространства, при действии цитостатиков и радиации, стимулируется избыточной активностью гуморальных факторов, в частности, катехоламинами и глюкагоном [330]

Результатом перераспределительного избытка восстановленного глутатиона во внеклеточном пространстве является десенситизация (снижение или утрата чувствительности) рецепторов, функциональная несостоятельность биорегуляторов, транспортных и других молекул пептидной природы и имеющие в своей структуре дисульфидную связь [217]. Иными словами формируется порочный круг, в котором нарушенный обмен восстановленного и окисленного глутатионов между клеткой и внеклеточным пространством, снижает возможность внеклеточных механизмов регуляции её адаптивных реакций нормализовать клеточный метаболизм, что в свою очередь еще более нарушает тиол-дисульфидный обмен, усугубляющий расстройства внеклеточной регуляции.

Необходимо напомнить, что к важным патогенетическим механизмам развития не только воспаления, но и опухолевой прогрессии относится

дисбаланс цитокинового профиля с преимущественной гиперпродукцией провоспалительных цитокинов [6, 10]. При проведении клинических

исследований установлено, что химиолучевая терапия больных раком ОФО сопровождается дозозависимым ростом количества провоспалительных цитокинов: IL-1P, IL-6 и TNF-a в крови. Так при достижении суммарной очаговой дозы облучения 40 Гр концентрация IL-ip, IL-6 возросла в среднем в 3 раза по сравнению с уровнем изучаемых показателей до ХЛТ. В более поздний срок ХЛТ при дозе облучения в 60 Гр количество этих цитокинов достигло величин, превышающих исходный уровень в 3-4 раза. Однако наибольший рост выявлен у TNF-a, его концентрация на фоне ХЛТ и развития оральных мукозитов повысилась при суммарной дозе облучения в 40 Гр в среднем в 6 раз, а при 60Гр - более чем в 8 раз по сравнению с исходным уровнем. Что же касается противовоспалительного IL-4, то его концентрация изменялась в меньшей степени, чем у провоспалительных цитокинов. Такого рода сдвиги в цитокиновом балансе могут свидетельствовать о развитии у онкологических больных оксидативного стресса с последующим формированием химиолучевого орального мукозита.

Для уточнения возможных механизмов фармакологической активности препарата моликсан (Na^SSG-инозин) по профилактике и лечению оральных мукозитов было изучено его влияние на постлучевые сдвиги в уровне про- и противовоспалительных цитокинов в крови больных раком ОФО на фоне химиолучевой терапии. Лечебное применение препарата моликсан (Na^SSG-инозин) способствовало восстановлению цитокинового баланса в сыворотке крови больных основной группы на уровне показателей «до ХЛТ». Это проявилось в снижении (в среднем в 2,5-3 раза по сравнению с контрольной группой) количества провоспалительных цитокинов и увеличении (в 1,5 - 2 раза) концентрации противовоспалительного цитокина IL-4 в крови больных основной группы.

Следует отметить, что лечебное применение Na^SSG-инозина оказало нормализующее влияние на концентрацию эпидермального фактора роста (EGF) в крови онкологических больных раком ротоглотки на фоне ХЛТ, а также значительно уменьшало частоту развития клинических проявлений и способствовало нормализации концентрации изучаемых пептидов.

Выявлено, что лечебное применение органической соли дисульфида глутатиона и инозина (моликсан) способствовало восстановлению чувствительности рецепторов к регуляторным пептидам, в частности, к EGF и колониестимулирующим факторам. Подтверждением правильности высказанного нами предположения могут служить результаты исследований выполненных Е.Б. Буровой и др. [14] и Л.С. Куриловой и др.[74].

На клетках А431 авторами изучалось действие синтетического фармакопейного аналога окисленного глутатиона (глутоксим) на активность рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), контролируемые им транскрипционные факторы STAT1 и STAT3, Ras-зависимые сигнал передающие MAP-киназы - ERK1,2, в сравнении с GSSG и эпидермальным фактором роста (EGF). Клетки эпидермоидной карциномы человека линии А431 имеют экстраординарно высокий уровень экспрессии рецептора эпидермального фактора роста, что позволяет с высокой степенью достоверности интерпретировать получаемые результаты по статусу активации рецептора эпидермального фактора роста (EGF) и EGF-зависимых сигнальных систем. Основным свойством сигнал-передающих белков млекопитающих является способность к фосфатной модификации аминокислотных остатков. Количественная оценка способности к фосфатной модификации проводится посредством регистрации степени фосфорилирования изучаемых белков в лизатах обработанных препаратами клеток по сравнению с лизатами необработанных (контрольных) клеток. Степень фосфорилирования отражает уровень активации изучаемых белков под действием исследуемого препарата. EGFR-рецепторная тирозинкиназа, проявляющая сродство к EGF, демонстрирует активность при образовании

димера за счет дисульфидных связей.

Глутоксим и дисульфид глутатиона (GSSG) стимулировали EGFR при концентрациях 0,002-0,02 ммоль/л, что соответствует содержанию GSSG в межклеточной жидкости [14, 74]. Активность EGFR появлялась через 5 мин после внесения веществ, отсутствовала на 10 и 30 мин, была максимальна на 60 мин, не определялась в последующем. Действие глутоксима и GSSG на клетки сопровождалось активацией MAP-киназ - ERK1,2, фактора STAT3, но не STAT1. Активация цитоплазматических белков имела волнообразный характер, определялась на 1, 4, 8, 16 и 24 часах инкубации. Глутоксим по активирующему влиянию на исследуемые молекулы превышал GSSG, но уступал EGF. Глутоксим, как и GSSG при введении с EGF, повышали сродство EGFR к EGF. Эффект всех исследуемых соединений на EGFR, контролируемые им сигнал передающие белки STAT3, MAP-киназы - ERK1,2, отменялся селективным ингибитором EGFR - AG1478. Результаты исследований указывают на способность препарата глутоксим восстанавливать функционально активную конформацию рецепторов цитокинов и, соответственно, чувствительность клеток к воздействию цитокинов, что позволяет объяснить ряд фармакологических эффектов препарата действием эндогенных цитокинов.

По-видимому, фармакологическое действие дисульфидов глутатиона и, в частности, препарата Na^SSG-инозин направлено на восстановление функциональной активности поверхностно-клеточных рецепторов различных семейств, внеклеточных регуляторных и транспортных молекул пептидной природы, содержащих сульфгидрильные группы (рис. 5).

Рисунок 5 - Действие дисульфид глутатиона содержащего препарата Na^SSG-инозин на поверхностно-клеточные рецепторы приводит к формированию их функционально-активной конформации

Важно, что препараты, содержащие в своей структуре дисульфиды глутатиона, участвует в окислении тиоловых групп рецепторов цитокинов, что необходимо для их перехода в функционально активную конформацию.

На основании выше изложенного можно заключить, что дисульфиды глутатиона и препараты их содержащие вызывают плейотропные эффекты (рис. 6).

Рисунок 6 - Плейотропные эффекты дисульфидов глутатиона содержащих препаратов

При этом действующее начало дисульфиды глутатиона содержащих препаратов является окисленный глутатион. Изменение соотношения окисленного / восстановленного глутатиона позволяет регулировать редокс- статус клеток и управлять функциями белков посредством обратимого образования смешанных дисульфидов между цистеинами белков и глутатионом. Этот процесс называется глутатионилирование белков [214, 313, 314, 315, 316, 317]. Кроме того, глутатионилирование белков при помощи дисульфидов глутатиона обеспечивает плейотропные эффекты на различные клеточные функции, включая внутриклеточные сигнальные

каскады, архитектуру цитоскелета и продукцию цитокинов [321].

Таким образом, применение дисульфидов глутатиона способствует восстановлению чувствительности рецепторов к регуляторным пептидам, в частности, к эпидермальному фактору роста (EGF) и колониестимулирующим факторам. Подтверждением тому служат полученные нами данные об активации процессов фосфорилирования рецепторов под влиянием дисульфида глутатионсодержащего препарата моликсан (Na^SSG-инозин). Включение каскада биохимических реакций по активации сигнал передающих белков, таких как митоген-активируемых и экстраклеточно регулируемых протеинкиназ (МАР-киназ ERK 1,2) реализуется стимуляцией транскрипционных белков c последующей активацией процессов пролиферации и дифференцировки.

Так, в ответ на воздействие эпидермального фактора роста или цитокинов в клетке запускается система передачи и усиления этих сигналов, работающих по каскадному типу активации (фосфорилирования) определенных белков в определенной последовательности [95]. При участии интегриновых рецепторов активируется ERK/МАР-киназный сигнальный путь [180]. Функционирует ERK/МАР-киназный каскад следующим образом: митогенный сигнал с клеточной поверхности поступает через цепь протеинкиназ на МАР-киназу (ERK 1,2), которая в цитоплазме покоящихся клеток находится в комплексе с нефосфорилированной формой ERK/МАР- киназы [130]. В ответ на митогенный стимул фосфорилируется (активируется) экстраклеточно регулируемая киназа ERK 1,2. Часть активированной формы ERK 1,2 транслоцируется в ядро, где фосфорилирует и активирует транскрипционные факторы, инициирует процесс пролиферации. В то же время происходит массивное перемещение комплекса ERK/МАР-киназы из цитоплазмы в ядро [337]. Таким образом, в покоящихся клетках экстраклеточно регулируемые протеинкиназы (ERK 1,2) и митоген- активируемые киназы (МАР-киназы) локализованы в цитоплазме, а активация МАР-киназного каскада приводит к ядерной локализации этих протеинкиназ [126].

Обращает на себя внимание тот факт, что применение препарата Na^SSG-инозин в качестве средства сопровождения противоопухолевого лечения умеренно повышает локальный контроль опухоли при химиолучевой терапии рака орофарингеальной области. По данным Е.И. Филатовой и др. [116], Г.М. Манихаса и др. [78] применение препарата дисульфида глутатиона (Na₂GSSG) при лучевой терапии рака шейки матки способствует умеренному повышению эффективности лечения (усиливается локальный контроль за опухолью), профилактике и/или уменьшению выраженности клинических проявлений осложнений (ректитов, цервицитов и гемодепрессии), вызванных радиационным поражением нормальных тканей. Кроме того, как показали некоторые отечественные и зарубежные исследователи с помощью дисульфидов глутатиона - фармакологических препаратов глутоксим и NOV002, возможно ослабить цитотоксическое действие цитостатиков при сохранении их терапевтической активности [32, 163, 168, 169, 202, 238, 290, 333]. По-видимому, фармакологическое действие дисульфидов глутатиона направлено на восстановление функциональной активности поверхностно-клеточных рецепторов различных семейств, внеклеточных регуляторных и транспортных молекул пептидной природы, содержащих сульфгидрильные группы [188].

Анализ результатов выполненных экспериментальных и клинических исследований позволяет заключить, что эффективность средств профилактики и лечения химиолучевых оральных мукозитов при химиолучевой терапии рака орофарингеальной области, по-видимому, может определяться их способностью:

- оказывать стимулирующее влияние на синтез и активность антимикробных пептидов в облученном организме и тем самым восстанавливать баланс микробиоценоза на слизистой полости рта в

условиях химиолучевой терапии;

- восстанавливать чувствительность рецепторов клеток костного мозга и слизистой оболочки полости рта к соответствующим эндогенным лигандам-активаторам пролиферации и дифференцировки;

- стимулировать пролиферацию и дифференцировку клеток костного мозга и эпителия слизистой оболочки полости рта;

- оказывать ингибирующее влияние на процессы перекисного окисления липидов и синтез провоспалительных цитокинов в облученных тканях;

- обеспечивать сохранение баланса про- и противовоспалительных цитокинов и снижать, тем самым, выраженность воспалительных процессов в СОПР больных с раком ОФО, получающих химиолучевую терапию;

- предупреждать и/или ослаблять клинические проявления химиолучевого орального мукозита у больных раком ОФО;

- обеспечивать проведение ХЛТ в полном объеме при сохранении высокого качества жизни онкологических больных.

В условиях наших исследований применение препаратов, содержащих дисульфиды глутатиона, в качестве средств сопровождения химиолучевой терапии рака ОФО позволило сохранить структурно-функциональную целостность дефензинов, в частности, а и Р-дефензинов, а также sIgA, и обеспечить тем самым нормальный микробиоценоз слизистой оболочки полости рта. Кроме того, под влияние дисульфидов глутатиона происходило восстановление функциональной активности поверхностно-клеточных рецепторов различных семейств, внеклеточных регуляторных и транспортных молекул пептидной природы, содержащих сульфгидрильные группы. В конечном счете, вышеизложенное представление о роли активации рецептор опосредованного сигнального пути в стимуляции дисульфидами глутатиона синтетических процессов в ДНК радиочувствительных клеток находит свое отражение в повышении активности пролиферативных процессов в поврежденных тканях и восстановлении целостности слизистой оболочки полости рта онкологических больных и профилактике, тем самым, химиолучевых оральных мукозитов и гемодепрессии.

К основным патогенетическим звеньям фармакологической активности по профилактике и лечению химиолучевых оральных мукозитов препаратов, содержащих дисульфиды глутатиона, следует отнести:

- снижение прооксидантной и усиление антиоксидантной активности;

- уменьшение уровней провоспалительных цитокинов (IL-ip, TNF-a и IL-6) и повышения содержания противовоспалительного цитокина IL-4;

- индукция синтеза антимикробных пептидов (кателицидина LL 37 и дефензинов a-дефензина (HNP 1-3) и Р-дефензина (hBD3), а также секреторного иммуноглобулина А (sIgA);

- восстановление микробиоценоза СОПР;

- устранение химиолучевой десенситизации рецептора (EGFR) и восстановление лиганд-рецепторного взаимодействия эпидермального фактора роста (EGF) и других эндогенных лигандов - колониестимулирующих факторов;

- включение каскада биохимических реакций по активации сигнал передающих белков, таких как митоген-активируемых и экстраклеточно регулируемых протеинкиназ (МАР-киназ ERK 1,2);

- стимуляция транскрипционных белков c последующей активацией процессов пролиферации и дифференцировки клеток костного мозга и СОПР.

Результаты проведенных исследований указывают на целесообразность использования препаратов, содержащих дисульфиды глутатиона в качестве средств сопровождения химиолучевой терапии местнораспространенного рака орофарингеальной области для профилактики и лечения химиолучевых оральных мукозитов и гемодепрессии.