Тема № 4. Значение клеточных белков в оценке гистогенеза опухолей

Для иммуногистохимического анализа опухолей и их метастазов приме­няется широкий спектр маркеров, к которым можно отнести: тканеспецифиче­ские белки - белки промежуточных филаментов (ПФ), компоненты базальной мембраны, рецепторы, молекулы клеточной адгезии и др.

Для иммуногистохимической верификации опухолей человека используют антитела к белкам ПФ. Промежуточные филаменты вместе с микротрубочками и микрофиламентами составляют цитоскелет всех клеток эукариотов. Свое назва­ние ПФ (диаметр 10 нм) получили из-за того, что они тоньше микротрубочек (диаметр 24 нм), но толще микрофиламентов (диаметр 7 нм). Основная функция ПФ - создание внутриклеточного каркаса, механическое поддерживание плазма­тической мембраны в местах соприкосновения с другими клетками и внеклеточ­ным веществом, а также поддержание ядерной оболочки. ПФ не подвергаются циклическим изменениям, как это происходит с микрофиламентами и микротру­бочками. В клетке ПФ достаточно стабильны, даже после обработки клеток де­тергентами они остаются интактными, в то время как большинство микротрубо­чек и микрофиламентов в клетках деполимеризируются до растворимых форм.

Все промежуточные филаменты разделены на шесть групп:

кислые цитокератины (молекулярная масса 40-64 кДа), по каталогу ци­токератинов R. Moll (1998) они имеют порядковые номера № 9-20;

нейтрально-основные цитокератины, № 1-8 (молекулярная масса 52.5­68 кДа);

виментин (молекулярная масса 58 кДа), располагается в мезенхимальных клетках: фибробластах, остеоцитах и остеобластах, хондроцитах, шванновских

клетках, меланоцитах кожи, лейкоцитах, плазматических клетках, эндотелии сосудов, некоторых эпителиальных клетках; десмин мышечных клеток (моле­кулярная масса 54 кДа) - в клетках скелетных мышц, кардиомиоцитах, гладко­мышечных клетках висцеральных органов и кровеносных сосудов; глиальный фибриллярный кислый белок (молекулярная масса 55 кДа) - маркер астроцитар- ных клеток; периферин распределяется в нейронах периферической нервной системы;

белки нейрофиламентов (молекулярная масса 68, 145 и 220 кДа) и альфа- интернексин;

ядерные ламины формируют оболочку ядра, их экспрессия связана со степенью дифференцировки клетки;

белок нестин экспрессируется в стволовых клетках нейроэпителия.

Иммуногистохимическое изучение с помощью моноклональных антител белков ПФ в опухолевых клетках различных эпителиальных и мезенхимальных новообразований показало, что в них стойко сохраняются те белки, которые ха­рактерны для ПФ нормальных клеток, явившихся источником развития данной опухоли, причем сохранность белков не зависит от степени анаплазии опухоле­вых клеток и зрелости новообразования в целом. Таким образом, выявление ПФ в опухолевых клетках с помощью специфических антител к различным ПФ по­зволяет определить эпителиальное, мезенхимальное или нейроэктодермальное происхождение опухолевых клеток, поставить диагноз и назначить адекватное

лечение.

Цитокератины - маркеры различных типов эпителия

Наиболее многочисленной группой белков ПФ являются цитокератины. Цитокератины - белки промежуточных филаментов цитоскелета эпителиаль­ных клеток. Клетки различных эпителиев имеют разные молекулярные формы цитокератина.

В настоящее время выявлено 20 типов цитокератинов CK1-CK20. Спектр цитокератинов в эпителиальных клетках зависит от типа дифференцировки, по­ложения клетки в эпителиальном пласте.

В клетках простого однослойного эпителия экспрессируется CK8 и CK18. Эти низкомолекулярные цитокератины выявляются в клетках печени, поджелудочной железы, большинстве эндокринных клеток и эпителиальных клетках проксимальных извитых канальцев почек. Эпителиальные клетки же­лудочно-кишечного тракта, желчных протоков и протоков поджелудочной же­лезы, легочных альвеол, эндометрия и собирательных трубочек почек также содержат CK7 и CK19. Нормальные клетки фолликулов щитовидной железы экспрессируют CK7, но не содержат CK19 и CK20. В базальном слое кожи CK20 окрашивает эндокринные клетки Меркеля. Железистый эпителий, с вы­раженным базальным или миоэпителиальным клеточным слоем (базальные и миоэпителиальные клетки молочной железы, потовых и слюнных желез, пред­стательной железы) экспрессирует CK5, CK14 и CK17, в то время как в секре­торном эпителии выявляются цитокератины CK8, CK18, CK7, CK19.

В многослойном плоском эпителии базальный слой может экспрессиро­вать CK5 и CK14, представляя цитокератины высокого молекулярного веса, а также CK19 (за исключением кожи). Средний и поверхностный слои неорого- вевающего многослойного плоского эпителия слизистых оболочек экспресси­руют CK4 и CK13, в эпидермисе экспрессируются CK1 и CK10.

В переходном эпителии во всех клетках выявляются цитокератины CK8, CK18, CK19 и CK7, в то время как поверхностные «зонтичные» клетки специ­фически экспрессируют CK20.

В мезотелии выявляются цитокератины CK8, CK18, CK19, CK7 и цито­кератины многослойного эпителия CK5, CK14, CK17.

Таким образом, присутствие цитокератинов в клетке является признаком, который может быть использован для идентификации эпителия: каждому виду эпителиальных клеток с определенной функцией и локализацией соответствует характерный набор цитокератиновых полипептидов.

Цитокератины в диагностике опухолевых заболеваний

В новообразованиях человека установлены определенные закономерно­сти экспрессии белков ПФ.

Злокачественные опухоли из эпителия экспрессируют цитокератины, вы­являемые и в неизмененных клетках того же гистогенеза. Аденокарциномы в основном экспрессируют цитокератины однослойного эпителия - CK8, CK18, CK19 и часто CK7. В клетках переходноклеточного рака и рака из клеток Мер­келя сохраняются биохимические свойства нормальных клеток и выявляется CK20. В анапластических клетках плоскоклеточного рака встречаются CK5, CK6, CK14, CK16 и CK17.

Неэпителиальные опухоли, как правило, цитокератин-негативны, однако некоторые мезенхимальные опухоли, такие как лейомиома, рабдомиосаркома, меланома, шваннома и анапластическая крупно-клеточная лимфома могут экс­прессировать цитокератины CK8, CK18, CK19. Эпителиоидная саркома, хон­дрома и амелобластома экспрессируют цитокератины простого эпителия (CK8, CK18, CK19). Синовиальная саркома и злокачественная мезотелиома экспрес­сируют цитокератины однослойного эпителия, однако в области расположения дифференцированных клеток возможна экспрессия и высокомолекулярных ци­токератинов, характерных для многослойного плоского эпителия.

Цитокератины - важные маркеры для иммуногистохимической класси­фикации недифференцированных опухолей.

Для выявления цитокератинов в опухолевых клетках часто используются так называемые общие цитокератины (клоны AE1/AE3 и MNF 116, Dako) - ан­титела с широкой специфичностью к различным эпителиям, они могут приме­няться для дифференциальной диагностики рака с большинством неэпители­альных опухолей. Антитела к общему цитокератину можно использовать для выявления микрометастазов или разбросанных опухолевых клеток в лимфати­ческих узлах и костном мозге, инфильтрирующего роста при раках желудка и молочной железы.

Преимущественная экспрессия цитокератинов многослойного плоского эпителия высокого молекулярного веса, таких как CK5 и CK13, в опухолях ха­рактеризует плоскоклеточную дифференцировку и помогает выявить слабо дифференцированные плоскоклеточные опухоли. CK8, CK18 и CK19 могут экс­прессироваться как в аденокарциномах, так и в плоскоклеточных раках, в таких случаях наличие CK5 и отсутствие экспрессии CK7 позволяет предположить плоскоклеточный рак.

Из внутримозговых опухолей цитокератины экспрессируют: папилломы хориодного сплетения и злокачественные папилломы хориодного сплетения, некоторые менингиомы, в то время как глиомы и низкодифференцированные нейроэктодермальные опухоли CK-негативны.

Антитела к плоскоклеточному эпителию CK5 выявляют базальные эпите­лиальные и миоэпителиальные клетки и таким образом могут помочь в выявле­нии инвазии при раке предстательной и молочной желез.

Для переходноклеточного рака мочевого пузыря экспрессия CK13 и CK20 является хорошим прогностическим признаком. Начало экспрессии CK14 в пе­реходноклеточном раке свидетельствует о плоскоклеточной дифференцировке и неблагоприятном прогнозе. В папиллярных уротелиальных опухолях нор­мальный (поверхностный) тип экспрессии CK20 характерен для нерецидиви­рующих опухолей и может быть использован для дифференциальной диагно­стики между инвазивными и неинвазивными опухолями.

Экспрессия CK7 без коэкспрессии CK20 характерна для аденокарциномы легких, молочной железы, эндометрия и щитовидной железы, а также для не­муцинозной аденокарциномы яичников и злокачественной мезотелиомы.

Типичным антигенным паттерном для рака толстого кишечника является экспрессия цитокератинов, характерных для эпителия тонкого кишечника, CK20 и отсутствие экспрессии CK7.

Экспрессия CK7 и CK20 характерна для переходноклеточного рака моче­вого пузыря, муцинозного рака яичников и аденокарцином желудка, желчных путей и поджелудочной железы.

В свою очередь, гепатоцеллюлярный рак, рак предстательной железы, почечноклеточный рак и мелкоклеточный рак легких не экспрессируют CK7 и CK20.

С.В. Петров, Н.Т. Райхлин (2000) на первом этапе, при диагностике ана­пластических опухолей, предлагают использовать 4 типа антител - к вименти- ну, цитокератинам (CK-Pan), белку S-100 (представляющему семейство Са²⁺- связывающих белков, которые обнаружены в клетках различных тканей) и об­щему лейкоцитарному антигену. Если ИГХ реакция будет везде положительной или везде отрицательной - это расценивается как артефакт. Если положитель­ная реакция отмечается только на виментин, то ставится диагноз саркома (либо семинома). При положительной реакции на виментин и белок S-100, эта опу­холь оценивается как липосаркома или меланома. Если положительная окраска на виментин сочетается с реакцией на общий лейкоцитарный антиген - и в ред­ких случаях низкомолекулярные цитокератины, то предполагается наличие лимфомы. При положительной реакции на цитокератины и в виде исключения на белок S-100 - виментин, можно думать о низкодифференцированном раке, герминоме и о других опухолях.

На втором этапе удается разделить цитокератин-позитивные низкодиф­ференцированные опухоли на переходноклеточные, плоскоклеточные, нейро­эндокринные раки, аденокарциномы и мезотелиому.

Если положительная реакция на цитокератины, характерные для плоского эпителия (CK5, CK13), сочеталась с положительной реакцией на цитокератины однослойного эпителия (CK8, CK18, CK19, CK7), то это - переходноклеточный рак или некоторые протоковые аденокарциномы.

При положительной реакции на широкий спектр цитокератинов и вимен- тина, это - мезателиома либо синовиальная или эпителиоидная саркома, либо некоторые раки щитовидной железы, почки и другие редкие раки.

В случае коэкспрессии CK8, CK7, CK18 с общим лейкоцитарным антиге­ном предполагается анапластическая крупноклеточная лимфома, диагноз кото­рой уточняется с помощью антител к CD-30, антигену ALCL.

Если положительная реакция на CK8, CK18, CK19 и CK7 сочеталась с от­рицательной реакцией на CK5, CK6, CK14, CK16 и CK17, то эта опухоль явля­лась аденокарциномой, которая в дальнейшем тестировалась на раковоэмбрио­нальный антиген (РЭА). Выраженная реакция на РЭА свидетельствует о раке толстого кишечника, желудка, поджелудочной железы, желчных протоков. Слабая реакция на РЭА наблюдается при раке мочевого пузыря, молочной же­лезы, шейки матки, легкого (при плоскоклеточном крупноклеточном вариан­те). Отрицательная реакция на РЭА наблюдается в клетках аденокарциномы простаты, почки, печени, яичников, щитовидной железы, эндокриноклеточных раковых опухолях.

Третий этап имеет цель определить органную локализацию анапластиче­ской опухоли с иммунофенотипом РЭА (+), CK8, CK18, CK19, CK7 (+) и про­водится с помощью органоспецифических маркеров.

При раке простаты выявляется специфический антиген простаты (PSA) и щелочная фосфатаза, специфичная для простаты (PAP), при раке щитовидной железы - тиреоглобулин, в клетках печеночноклеточного рака - альфа- фетопротеин, рака яичника - СА-125, хориоэпителиомы - хорионический гона­дотропин. Клетки эндокринных раков экспрессируют нейрон-специфическую энолазу (NSE), хромогранин и др. Положительные на виментин и отрицатель­ные на общий цитокератин (CK-Pan) мягкотканые опухоли являются новообра­зованиями мезенхимальной природы (лимфомы, саркомы), некоторыми нейро­генными опухолями, либо меланомами.

Анапластические опухоли, дающие окраску на виментин подразделяются на лимфомы (Т- и В-клеточные), меланому (положительная реакция с белком S- 100), миогенные саркомы (позитивные реакции на гладкомышечный актин, десмин, миоглобин), ангиосаркомы (реагирующие с антителами к фактору VIII свертывания крови, CD31), злокачественную фиброзную гистиоцитому (экс­

прессирует альфа-1-антитрипсин, CD68, лизоцим, альфа-1-антихимотрипсин, иногда белок S-100), фибросаркому, реагирует с виментином и CD34).