Введение

Актуальность темы исследования.

В общей структуре онкологической заболеваемости злокачественные опухоли области головы и шеи составляют около 20% [89]. Несмотря на заметный прогресс в изучении патогенеза, разработке новых методов диагностики и лечения опухолевых процессов различной локализации, в последние десятилетия онкологическая заболеваемость продолжает неуклонно возрастать [38, 122].

Отличительными особенностями новообразований органов полости рта и ротоглотки является быстрый темп роста, раннее лимфогенное и гематогенное метастазирование, резистентность к различным видам лечения, высокая смертность, достигающая 60-70% [66]. Несмотря на доступность опухолей органов полости рта и ротоглотки для визуального осмотра и совершенствование методов диагностики, более 2/3 больных к моменту установления диагноза имеют распространенный опухолевый процесс, а у 50% больных к моменту начала лечения определяются метастазы в регионарных лимфатических узлах [53, 89].

Основным методом противоопухолевого лечения злокачественных новообразований полости рта и ротоглотки в большинстве случаев (около 80%) считается одновременная химиолучевая терапия [231, 269]. Наиболее частым и ранним токсическим осложнением химиолучевого лечения, ограничивающим его эффективность, являются тяжелые оральные мукозиты (стоматиты) III-IV степени, частота развития которых достигает 70 % и более [220, 250].

Оральный мукозит III и IV степени в 70-80% случаев встречается у больных раком головы и шеи, получающих химиолучевую терапию, и в 4090% случаев у больных онкогематологического профиля, перенесших высокодозную химиотерапию и трансплантацию гемопоэтических клеток [100, 178]. В связи с этим возникает необходимость в поиске и разработке высокоэффективных средств профилактики и/или лечения тяжелых форм орального мукозита с целью повышения качества химио- и химиолучевой терапии рака головы и шеи [221].

При проведении химиолучевой терапии больным злокачественными опухолями потенциально возможны две проблемы: неполная регрессия опухоли и повреждение окружающих здоровых тканей. Характерной чертой течения лучевых повреждений слизистой оболочки полости рта является длительное, прогрессирующее течение, присоединение инфекционных осложнений, нарушение микроциркуляции, трофических и обменных процессов в облученных тканях [55].

Основной причиной развития токсических эффектов химиолучевой терапии является общность мишеней цитостатической терапии в опухоли и в нормальных тканях [41, 48, 206]. В этой связи развивающаяся при применении цитостатиков и радиационного воздействия токсичность является фактически продолжением их терапевтической активности и проходит через различные механизмы повреждения клетки. К этим механизмам относятся: повреждения генетического аппарата клетки; активация процессов свободно-радикального окисления; повреждения клеточных мембран; нарушения процессов синтеза белка и клеточного деления; нарушения энергетического обмена [56, 57, 132].

Тем не менее, патогенез побочного действия химиолучевой терапии, несмотря на кажущуюся полноту проведенных ранее исследований, изучен не достаточно для успешной профилактики и лечения оральных мукозитов.

Однако устоявшиеся представления о ключевых звеньях патогенеза орального мукозита, воздействуя на которые с помощью фармакологических средств можно было бы предупредить или существенно ослабить клинические проявления данного заболевания, в настоящее время отсутствуют [106, 300, 303]. Все вышеизложенное свидетельствует о высокой актуальности проблемы химиолучевых повреждений слизистой оболочки полости рта и ротоглотки у онкологических больных и необходимости разработки новых средств коррекции этих нежелательных эффектов с помощью на основе изучения ключевых звеньев патогенеза этого состояния.

Степень разработанности темы исследования.

По мнению большинства отечественных и зарубежных ученых, химиолучевая терапия рака орофарингеальной области является методом выбора в противоопухолевом лечении [2, 54, 100, 231]. Однако при использовании одновременной химиолучевой терапии количество оральных мукозитов III-IV степени возрастает до 60-100%. В связи с этим, коррекция мукозита как патогенетического фактора, лимитирующего токсичность лечения рака орофарингеальной области, является важной задачей не только клинической онкологии и стоматологии, но и патологической физиологии.

Терапия данного осложнения включает как локальное влияние на слизистую оболочку, так и системное фармакологическое воздействие [50, 138]. При этом выделяют несколько групп средств профилактики и лечения орального мукозита: противовоспалительные препараты, антимикробные средства, модификаторы биологического ответа, антиоксиданты, нефармакологические методы терапии [107, 112].

Для успешного поиска эффективных фармакологических средств коррекции этого состояния требуется разработка экспериментальных моделей лучевого и химиолучевого мукозита, применение которых позволило бы оценить воздействие повреждающих факторов химиолучевой терапии на организм экспериментальных животных системно и на слизистую оболочку полости рта локально, а также уточнить некоторые патофизиологические механизмы формирования данного заболевания. Необходимо также с помощью радиоизотопных, биохимических, иммунологических, микробиологических и фармакологических методов изучить основные звенья патогенеза оральных мукозитов, индуцированных химиолучевым воздействием на организм, что позволит обосновать новые подходы к лечению этого состояния [147, 276, 325].

В этой связи пристальное внимание патофизиологов было обращено на универсальную систему редокс-регуляции, являющейся одним из фундаментальных регуляторных механизмов передачи сигналов и экспрессии генов [244, 312]. Особую роль в редокс-регулируемых сигнальных путях играют эндогенные системы тиоредоксина и глутатиона - универсального трипептида, присутствующего в большинстве растений, микроорганизмов и во всех тканях млекопитающих [214]. Восстановленный глутатион (GSH) существует в клетке в равновесии с глутатионом дисульфидом (GSSG), и отношение концентраций GSH/GSSG служит показателем редокс-состояния клетки [71, 237]. Именно система глутатиона предотвращает окисление SH-групп или восстанавливает S—S-связи, индуцированные окислительным стрессом, инактивирует свободные радикалы и участвует в детоксикации ксенобиотиков (в том числе лекарственных веществ и канцерогенов) [214]. Этот и другие механизмы действия позволили препаратам глутатиона найти клиническое применение в качестве иммуномодуляторов и гемостимуляторов в комплексной терапии бактериальных и вирусных заболеваний [44], псориаза [64, 121], некоторых других состояний [14, 182].

Экспериментальные и клинические исследования, проведенные в последние годы, показали определенную эффективность дисульфида глутатиона препарата глутоксим в качестве средства сопровождения химиотерапии онкологических больных [32, 108]. Кроме того, в литературе представлены сведения о возможности использования глутоксима для профилактики и лечения основных осложнений лучевой терапии - эпителиита и гемодепрессии при противоопухолевой терапии рака шейки матки [78]. Однако данные о возможности повышения эффективности химиолучевой терапии рака орофарингеальной области с помощью дисульфидов глутатиона отсутствуют. Такого рода данные позволили бы разработать новые подходы к повышению эффективности профилактики и лечения орального мукозита, индуцированного химиолучевой терапией, и повысить, тем самым, качество противоопухолевого лечения.

С учетом актуальности проблемы и нерешенности вопросов патогенеза воспалительных и эрозивно-язвенных осложнений в ротовой полости у больных раком орофарингеальной области (ОФО) и необходимости их коррекции на фоне химиолучевой терапии были определены цель и задачи настоящего исследования.

Цель работы: патогенетическое обоснование применения дисульфидов глутатиона в качестве средств профилактики и лечения оральных мукозитов у больных раком орофарингеальной области.

Для выполнения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать экспериментальную модель орального мукозита при комбинированном химиолучевом воздействии, позволяющую адекватно воспроизводить основные клинические, микробиологические, иммунологические и биохимические нарушения в тканях ротовой полости онкологических больных при развитии у них химиолучевого орального мукозита.

2. Изучить особенности патогенеза и клинических проявлений химиолучевого орального мукозита у экспериментальных животных в условиях комбинированного радиационного и химического воздействия.

3. Исследовать возможность профилактики и лечения химиолучевых мукозитов у экспериментальных животных с помощью дисульфидов глутатиона.

4. В экспериментах in vitro на клеточных культурах и in vivo на животных исследовать возможные патофизиологические механизмы фармакологической активности дисульфидов глутатиона, в частности, органической соли дисульфида глутатиона и инозина, в профилактике и лечении орального мукозита.

5. Разработать патогенетически обоснованную схему коррекции орального мукозита у больных раком орофарингеальной области с помощью дисульфидов глутатиона на фоне химиолучевой терапии и изучить ее эффективность.

6. Изучить стоматологический статус больных местнораспространенным раком орофарингеальной области в процессе химиолучевой терапии без фармакологической коррекции оральных мукозитов и на фоне их профилактики и лечения.

7. Провести анализ непосредственных результатов химиолучевой терапии, качества жизни, частоты и тяжести ранних побочных осложнений у больных раком орофарингеальной области, получавших в качестве сопроводительной терапии препараты дисульфида глутатиона.

Научная новизна исследований.

Разработаны экспериментальные модели лучевого и химиолучевого орального мукозита у мелких лабораторных животных, адекватно воспроизводящие основные клинические проявления этого заболевания у человека при воздействии повреждающих факторов химиолучевой терапии.

Выявлены особенности нарушений микробиоценоза ротовой полости экспериментальных животных и установлена их взаимосвязь с изменениями содержания эффекторов врожденного иммунитета а-дефензина (HNP 1-3), P- дефензина (hBD3) и кателицидина LL-37, а также баланса

провоспалительных и противовоспалительных цитокинов IL-ip, IL-6, EGF, TNF-а и IL-4 при воздействии на организм факторов химиолучевой терапии (химического, и радиационного) на пике развития орального мукозита.

Сформулированы и научно обоснованы возможные механизмы действия дисульфидов глутатиона в качестве средств коррекции воспалительных и эрозивно-язвенных процессов в слизистой оболочке полости рта в условиях химиолучевой терапии больных раком ОФО.

Обоснована возможность восстановления чувствительности поверхностно-клеточных рецепторов клеток кроветворной ткани и слизистой оболочки полости рта к регуляторным цитокинам с помощью препаратов, содержащих дисульфиды глутатиона. Установлено, что нормализация с помощью препаратов дисульфидов глутатиона функциональной активности (чувствительности) поверхностно-клеточных рецепторов к эпидермальному фактору роста и лиганд-рецепторного взаимодействия обеспечивает способность эндогенных цитокинов ускорять восстановление пролиферации и дифференцировки клеток костного мозга и слизистой оболочки полости рта.

Показано, что тяжесть клинических проявлений орального мукозита при химиолучевой терапии рака ОФО во многом связана с наличием в организме онкологического больного (клетках слизистой оболочки полости рта) вирусной инфекции, вызываемой вирусом простого герпеса HSV-1.

Установлено, что применение органической соли дисульфида глутатиона и инозина - препарата Na2GSSG-инозин (моликсан) приводит к восстановлению баланса про- и противовоспалительных цитокинов IL-6, IL- ip, TNF-a и IL-4, а также иммуноглобулинов IgA и sIgA в крови и слюнной жидкости больных раком ОФО, получавших химиолучевую терапию. Показано, что включение в схему комплексной терапии химиолучевого орального мукозита у больных раком ОФО препаратов, содержащих дисульфиды глутатиона, способствует улучшению стоматологического статуса и баланса про- и антиоксидантной активности, восстанавливает содержание эффекторов врожденного иммунитета кателицидина LL-37, а- дефензина (HNP1-3) и Р-дефензина (hBD3), а также улучшает состояние микробиоценоза полости рта.

Патогенетически обоснована и оценена клиническая эффективность применения органической соли дисульфида глутатиона и инозина в качестве средства профилактики и лечения орального мукозита при химиолучевой терапии больных местнораспространенным плоскоклеточным раком ОФО.

Теоретическая и практическая значимость результатов исследования.

На основании результатов изучения патогенетических звеньев химиолучевых оральных мукозитов (стоматитов) и гемодепрессии разработана методика профилактики и лечения выявленных осложнений с использованием препаратов, содержащих дисульфиды глутатиона.

Доказано, что возникновение и развитие осложнений химиолучевой терапии рака орофарингеальной области (оральный мукозит и гемодепрессия) зависят не только от дозовой нагрузки лучевого воздействия, но и от дополнительного влияния химиотерапии - цитостатического фактора. Показана эффективность и безопасность применения органической соли дисульфида глутатиона и инозина препарата Ка₂ОББО-инозин (моликсан) при проведении одновременной химиолучевой терапии больных раком орофарингеальной области.

Установлено, что применение в качестве средства сопровождения химиолучевой терапии (ХЛТ) органической соли дисульфида глутатиона и инозина препарата моликсан индуцирует синтез антимикробных пептидов кателицидина LL-37, а-дефензина (HNP1-3) и Р-дефензина (hBD3), а это, в свою очередь, способствует восстановлению микробного баланса в слизистой оболочке полости рта. Обоснована возможность применения препарата Na^SSG-инозин (моликсан) для лечения химиолучевого орального мукозита, осложненного герпесвирусной инфекцией, вызываемой вирусами простого герпеса 1 типа (HSV-1).

Результаты оценки герпесвирусной нагрузки в крови онкологических больных до проведения химиолучевого лечения позволяют прогнозировать возможную (I-II или III-IV степень) тяжесть химиолучевых оральных мукозитов и подобрать адекватную терапию сопровождения. Выявлено, что использование органической соли дисульфида глутатиона и инозина препарата Na^SSG-инозин (моликсан) в качестве средства сопровождения химиолучевого лечения местнораспространенного рака ОФО III и IV стадии достоверно улучшает непосредственные результаты проводимого противоопухолевого лечения по сравнению со стандартной химиолучевой терапией, уменьшая при этом частоту и тяжесть побочных эффектов (орального мукозита и гемодепрессии) при сохранении высокого качества жизни онкологических больных.

Проведена подробная оценка стоматологического статуса больных местнораспространенным раком орофарингеальной области по критериям гигиены полости рта и состоянию пародонта на фоне клинических проявлений оральных мукозитов у больных раком ОФО, получающих химиолучевую терапию. Показано, что профилактика и лечение с помощью препарата ИагОББО-инозин (моликсан) способствует улучшению стоматологического статуса онкологических больных.

Доказано, что применение дисульфидов глутатиона в качестве средств сопровождения химиолучевой терапии рака ОФО обеспечивает улучшение непосредственных результатов лечения при сохранении высокого качества жизни больных, подвергшихся химиолучевому воздействию.

Методология и методы исследований.

В ходе выполнения диссертационной работы были проведены экспериментальные и клинические исследования.

Выполнение экспериментального раздела работы было направлено на патофизиологическое обоснование возможности применения дисульфидов глутатиона в качестве средств профилактики и лечения экспериментального орального химиолучевого мукозита. При выполнении клинического этапа работы проводили оценку эффективности дисульфида глутатиона препарата Ка₂О88О-инозин в качестве средства профилактики и лечения химиолучевых оральных мукозитов у больных раком орофарингеальной области.

Использованная в работе методология базируется на теоретических и практических основах патофизиологии и стоматологии, включает основные принципы формирования и обоснования патогенетических подходов к поиску и разработке средств профилактики и лечения оральных мукозитов (стоматитов) в условиях воздействия на организм химиолучевых повреждающих факторов.

В исследовании использовались основные клинические и лабораторные (биохимические, микробиологические, иммунологические и молекулярно-биологические) методы определения степени выраженности патологического процесса - орального мукозита как в эксперименте, так и в клинической практике онкологического стационара.

Объектом доклинического исследования явились экспериментальные животные (беспородные крысы самцы) с оральным лучевым и химиолучевым мукозитом, развивающимся при изолированном (у- облучение) и комбинированном (у-облучение и цитостатик цисплатин) воздействии. Предметом исследования служили клинические и лабораторные признаки экспериментального лучевого и химиолучевого орофарингеального синдромов.

Объектом клинического раздела исследования служили пациенты с признаками орального химиолучевого мукозита различной степени тяжести. Предметом исследования явились клинические и лабораторные проявления воспалительных и эрозивно-язвенных процессов в СОПР при химиолучевой терапии больных раком орофарингеальной области.

Работа выполнена в соответствии с принципами доказательной медицины с использованием современных биохимических, иммунологических, микробиологических, радиоизотопных и молекулярнобиологических методов исследования и обработки данных. Исследование проведено с соблюдением принципов и правил математико-статистического моделирования и исследования (отбор, рандомизация, формирование референтных групп, контроль, статистическая обработка результатов).

Экспериментальный и клинический разделы работы выполнены в дизайне рандомизированного контролируемого открытого сравнительного исследования.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанные экспериментальные модели химиолучевого

орального мукозита у мелких лабораторных животных адекватно воспроизводят основные клинические, биохимические, микробиологические и иммунологические проявления орофарингеального синдрома у онкологических больных, подвергающихся комбинированной химиолучевой терапии.

2. В патогенезе химиолучевого орального мукозита важную роль играет нарушение микробиоценоза в слизистой оболочке полости рта, обусловленное угнетением синтеза антимикробных пептидов - эффекторов врожденного иммунитета. Развитию воспалительных и эрозивно-язвенных процессов в слизистой оболочке полости рта также способствуют: активация свободно-радикальных реакций, повышение уровня провоспалительных цитокинов, десенситизация рецепторов эпидермального фактора роста и угнетение тем самым пролиферации клеток слизистой оболочки полости рта и костного мозга.

3. Применение в схемах профилактики и лечения химиолучевого орального мукозита препаратов, содержащих дисульфиды глутатиона, приводит к улучшению стоматологического статуса за счет снижения активности воспаления в слизистой оболочке полости рта, индукции антимикробных пептидов, нормализации микробиоценоза полости рта, восстановления структурно-функциональной целостности секреторных иммуноглобулинов А и рецепторов эпидермального фактора роста.

4. Органическая соль дисульфида глутатиона и инозина препарат

Na^SSG-инозин (фармакопейный препарат моликсан) является

эффективным лекарственным средством сопровождения одновременной химиолучевой терапии рака орофарингеальной области. Применение моликсана улучшает непосредственные результаты противоопухолевого лечения, предупреждает и/или ослабляет выраженность клинических проявлений химиолучевого орального мукозита (стоматита) и синдрома гемодепрессии.

Степень достоверности и апробация результатов.

Результаты получены на современном сертифицированном оборудовании: биохимический анализатор «BS-120» (Mindray, Германия), жидкостно-сцинтилляционный счетчик «RackBeta» (LKB, Швеция), анализатор «Immulite 2000» (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., США), анализатор «EVOLIS Twin Plus» (BIO RAD, США).

Степень достоверности полученных результатов определяется: достаточным количеством экспериментальных животных (680 белых беспородных крыс-самцов; 520 белых беспородных мышей-самцов и 140 мышей-самцов линии BALB/c), использованных в исследовании; достаточной выборкой больных раком орофарингеальной области (75 пациентов); рандомизацией и формированием групп сравнения и контроля; адекватными экспериментальными моделями лучевого и химиолучевого орального мукозита; применением современных высокочувствительных и информативных биохимических, иммунологических, микробиологических и молекулярно-биологических методик в экспериментальных и клинических исследованиях; корректными методами статистической обработки полученных результатов.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на III съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), международной научной конференции «Экспериментальная и клиническая фармакология» (Минск, 2007), международной научно-практической конференции «Отдаленные последствия воздействия ионизирующего излучения» (Киев, 2007), Российской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2011), Российской научной конференции «Острые проблемы разработки противолучевых средств: консерватизм или модернизация» (Москва, 2012), II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012), Юбилейной научно-практической конференции «Состояние и перспективы развития средств медицинской защиты от экстремальных факторов», посвященной 20-летию НПЦ «Фармзащита» ФМБА России (Москва, 2012), Российской научной конференции «VI Невский радиологический форум» (Санкт-Петербург, 2013), Международной научной конференции «Радиобиологические основы лучевой терапии опухолей» (Москва, 2013), VII съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2014).

Апробация диссертации проведена 14 июня 2014 года на расширенном заседании кафедр патологической физиологии, челюстно-лицевой хирургии и стоматологии, военной токсикологии и медицинской защиты, военнополевой терапии, НИЛ военной терапии НИО (экспериментальной медицины) НИЦ, НИЛ медицинский регистр НИО (экспериментальной медицины) НИЦ Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова (протокол № 4).

Реализация результатов исследования.

Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедр патологической физиологии, военной токсикологии и медицинской защиты, рентгенологии и радиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, кафедры терапевтической стоматологии Санкт-Петербургского государственного педиатрического медицинского университета, а также используются в научно-исследовательской работе НИИЦ (медикобиологической защиты) НИИИ военной медицины Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. Разработанная схема лечения химиолучевого орального мукозита с помощью дисульфидов глутатиона апробирована и применяется в клинической практике Санкт-Петербургского клинического онкодиспансера и городской клинической больницы № 8.

По результатам исследований получен патент на изобретение «Способ профилактики и лечения химиолучевых стоматитов при химиолучевой терапии рака орофарингеальной области» (изобретение № 2519164 по заявке № 201249718, зарегистрировано в Госреестре 14 апреля 2014 г.).

Связь темы диссертации с плановой тематикой научноисследовательской работы учреждения.

Исследования выполнялись в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова: тема НИР № VMA.02.04.02.0405/0219 (шифр «Новсолит»)

«Экспериментальная оценка эффективности литиевой соли глутатиона в качестве стимулятора кроветворения при гемодепрессиях радиационной и химической этиологии» и тема НИР № VMA.02.04.03.084/0091 (шифр «Новсолит-2») «Клинико-экспериментальное обоснование подходов к совершенствованию терапии гемодепрессивного и орофарингеального синдромов при изолированном и комбинированном радиационном поражениях».

Публикации.

По теме диссертационного исследования опубликована 31 научная работа, в том числе 11 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук, а также получен патент на изобретение.

Личный вклад автора.

Автор лично провела анализ литературных данных по теме диссертации, разработала и обосновала методические подходы к созданию моделей экспериментального орального мукозита, приняла личное участие в планировании, организации и проведении экспериментальных и клинических исследований. Ею лично были обследованы 75 пациентов с раком орофарингеальной области, среди них 36 больных, получавших химиолучевую терапию и лечение орального мукозита органической солью дисульфида глутатиона и инозина (препаратом моликсан). Автор лично осуществляла сбор и систематизацию первичных экспериментальных и клинических материалов, статистическую обработку полученных данных, их анализ и интерпретацию, написание диссертации.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 261 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации приведены 41 таблица и 6 рисунков. Список литературы содержит 344 библиографических источника, в том числе 126 отечественных и 218 иностранных публикаций.