Глава II. Материалы и методы.

В течение 3 лет (2005-2007гг.) на базе Морозовской детской городской клинической больницы (МДГКБ) и Детской инфекционной клинической больницы (ДИКБ) №6 УЗ САО г. Москвы было обследовано 104 пациента в возрасте от 2 до 16 лет.

Рисунок 1. Количественое соотношение пациентов обследованных групп.

Среди обследованных детей более половины (53.9%) составили дети старше 10 лет, 26.9% - дети в возрасте от 7до 10 лет, 19.2% - дети в возрасте от 2 до 6 лет. В целом количество девочек почти вдвое превышало количество мальчиков, так как основная группа детей была обследована на базе кардиоревматологического отделения МДГКБ для девочек.

В зависимости от возраста пациенты, составляющие основную группу исследования (77 детей с НРСиП), были разделены на три подгруппы: от 2 до 6 лет (I(_2-6) подгруппа -18детей - 23.4%); от 7 до 10 лет (II ₍₇.₁₀) подгруппа -21ребенок - 27.3 %) и от 11 до 16 лет (III ₍₁₁.₁₆) подгруппа - 38 детей - 49.3%). Соотношение мальчиков и девочек составило 3:5.

Все дети с выраженными ST-T изменениями были старше 10 лет. Количество девочек в три раза превышало количество мальчиков.

53

Все дети основной группы (77) и дети с ST-T изменениями (12) находились на стационарном лечении в отделениях МДГКБ и ДИКБ№6, из них 72 ребенка - в кардиологических отделениях. У 13 детей изменения на ЭКГ явились случайной находкой при обследовании по поводу неврологических (7), гастроэнтерологических (5) и бронхолегочных (1) заболеваний.

Учитывая особенности методики определения уровня сывороточных кардиоспецифических аутоантител, при отборе пациентов в основную группу и группы сравнения учитывались определенные критерии.

Общие критерии включения детей в исследование:

- нормальная температура тела и отсутствие других клинических проявлений острой инфекции или обострений хронической патологии на момент обследования ребенка.

- отсутствие анамнестических данных о перенесенных в течение предшествующих трех недель острых инфекциях, обострении хронических заболеваний, острых аллергических реакциях, а также предшествующей субфебрильной температуре тела.

- отсутствие лабораторных признаков течения острого или недавно перенесенного инфекционного процесса (нормальный уровень лейкоцитов, СОЭ, отсутствие сдвигов лейкоцитарной формулы, превышения значений неспецифических факторов воспаления).

- отсутствие Эхо-признаков врожденного порока сердца и сосудов, инфекционного эндокардита, новообразований сердца.

Критерием включения детей в основную группу являлось наличие одного или нескольких типов нарушения ритма сердца или проводимости,

Критерием включения в группу сравнения детей пациентов с нарушением процесса реполяризации являлось наличие изменения морфологии зубца Т, (изменение его амплитуды, сглаженность или его инверсия) в трех и более отведениях.

Критерием включения детей с вегетативной дисфункцией в группу сравнения являлось отсутствие у них ЭКГ-признаков какого-либо нарушения ритма сердца и проводимости, а также отсутствие нарушения процесса реполяризации во всех отведениях.

В соответствии с общепринятой классификацией, с учетом рекомендаций М.А. Школьниковой (1999) и Л.М. Макарова (2006), все выявленные варианты аритмии были сгруппированы по типам и представлены в таблице 1 (Табл.1).

В основной группе детей нарушения ритма сердца и проводимости были представлены: гетеротопными тахиаритмиями (ГТТА) - 13 (16.9%)

пациентов, из них с хронической непароксизмальной тахикардией (ХНТ) - 5 детей, с пароксизмальной тахикардией (ПТ) - 8; экстрасистолией (ЭС) - 25 (32.5%) пациентов; синдромом слабости синусового узла I-II типов (СССУ) - 17 (22.1%) детей; полной блокадой правой ножки пучка Гиса (ПБПНПГ) - 5 (6.5%) детей; синдромом удлиненного QT - (QT) 6

(7.8%) пациентов; AV - блокадой I-III степени (AV) - 7 (9.1%) детей; 3 ребенка с хронической синусовой тахикардией и 1 ребенок с мерцательной аритмией (Табл.1).

Таблица 1. Распределение различных типов НРСиП в основной группе детей.

Анализ клинико-анамнестических данных осуществлялся на основании изучения субъективных жалоб пациентов, информации полученной в ходе бесед с родителями, результатов предшествующих стационарных и амбулаторных обследований, а также данных амбулаторных карт пациентов.

стационар и частота жалоб в анамнезе.

Помимо оценки анамнестических и физикальных данных, всем детям проведены общеклинические лабораторные исследования (общий анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови). Инструментальное обследование включало электрокардиографию в 12 отведениях (ЭКГ), эхокардиографию (ЭхоКГ), холтеровское мониторирование ЭКГ (ХМ). Рентгенография черепа, электроэнцефалография (ЭЭГ), эхоэнцефалография (ЭхоЭГ) выполнялись по показаниям.

Электрокардиография, эхокардиография и холтеровское мониторирование ЭКГ проводились в отделении функциональной диагностики МДГКБ (зав. отделения Л. Ю. Неижко ), на кафедре Детских болезней РУДН (зав. каф. д.м.н. Л.Г. Кузьменко) и ДИКБ №6 (гл. врач д.м.н. Е. А. Дегтярева).

Электрокардиография проводилась с использованием электрокардиографа SHILLER (США) по общепринятой методике, включающей 12 отведений (3 - стандартных, 3 - усиленных от конечностей и 6 - однополюсных грудных). Всем детям исследование проводилось в положении лежа, стоя и по показаниям после физической нагрузки. Детям с ST-T изменениями проводилась калий-обзидановая проба. Оценивался ритм, положение электрической оси сердца, зубцы Р и Т , комплекс QRS, интервалы Р-Q и Q-Т и сегмент ST во всех отведениях.

Эхокардиография проводилась на аппарате VIVID 3 (Израиль) в положении лежа на спине и левом боку с использованием стандартных эхокардиографических позиций, по общепринятой методике, включающей одномерное исследование (М-режим), двухмерное исследовании (В-режим) и доплеровское исследование. Оценивались конечный-систолический (КСР) и конечный-диастолический (КДР) размеры левого желудочка, фракция выброса, размеры обоих предсердий и правого желудочка, толщина межжелудочковой и межпредсердной перегородок, состояние клапанов, наличие малых аномалий развития сердца, состояние перикарда.

Холтеровское мониторирование ЭКГ проводилось в отделении функциональной диагностики МДГКБ, с использованием аппарата SHILLER (США).

определением их природы и количества, а также наличие куплетов, триплетов и пробежек; наличие пауз ритма за счет нарушения атриовентрикулярного проведения или остановок синусового узла; продолжительность интервала QT при максимальной и минимальной ЧСС,

по показаниям оценка корригированного интервала (^Т) - С)Тс

(рассчитывается по формуле QTc=QT/jRR);вариабельность сердечного ритма с определением основного уровня функционирования СУ, функции разброса, концентрации, оценка симпатических и парасимпатических влияний.

С целью изучения методом иммуноферментного анализа (ИФА) сывороточного содержания естественных кардиотропных аутоантител (аАТ) и выявления степени и характера инфицированности вирусами семейства Herpesviridae обследованных нами пациентов у детей всех групп проводился забор крови из кубитальной вены. Сыворотка получалась путем центрифугирования согласно стандартной процедуре. Свежие образцы хранились не более одной недели при t 2-8°С в условиях отсутствия микробной контаминации. Большинство образцов подвергались однократному замораживанию и хранились при t минус 20°С.

Исследование сывороточного содержания естественных карДиотропных аутоантител у пациентов всех групп проводились с помощью специализированных сертифицированных ИФА-наборов (ЭЛИ- Кардио-Тест; производства МИЦ «Иммункулус», Москва) на базе лаборатории МИЦ «Иммункулус» (Москва) под руководством д.м.н. проф. А. Б. Полетаева (Научно-исследовательский институт нормальной физиологии РАМН). Методика группы ЭЛИ-Тест (сокращение от ELISA - Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay), разработанная проф. А. Б. Полетаевым применяется в целях выявления специфических иммунных изменений, способных оказывать влияние на деятельность клеток различных органов и тканей. Развитие заболеваний сопровождается стойкими изменениями синтеза и распада молекулярных компонентов клеток организма, что неизбежно находит отражение в изменении сывороточного содержания тех или иных аутоАТ [118, 119, 120, 121, 122].

кардиотропных аутоантител.

В каждой пробе сыворотки определяли содержание аутоантител класса IgG, специфически направленных к цитоплазматическому белку кардиомиоцитов COS-05-40, белку мембран цитоскелета кардиомиоцитов COM-015-15, кардиальным [^адренорецепторам (eAR) и нитридоксид- синтетазе (NO-синтетазе (NOS)).

Следует отметить, что значение отклонений от нормы различных типов кардиотропных аАТ неодинаково. Так аутоантитела, специфически направленные к цитоплазматическому белку кардиомиоцитов (COS-05-40) АТ к NO-синтетазе (NOS), свидетельствуют об обратимых

метаболических невоспалительных и вегетативно-опосредованных изменениях в миокарде, в то время как аутоантитела к белку мембран цитоскелета кардиомиоцитов (COM-015-15) и аАТ к в1-адренорецепторам могут указывать на более грубые комплемент-зависимые деструктивные изменения в миокарде и проводящей системе сердца, приводя к развитию ремоделирования миокарда с дисфункцией левого желудочка.

С другой стороны - повышенная продукция аАТ в1-адренорецепторам может быть вторичной реакцией и отражать первичное патологическое повышение мембранной деструкции в1-адренорецепторов, связанной с метаболическими нарушениями или с влияниями инфекционных агентов[118, 119, 120, 121, 122].

Определение сывороточного содержания естественных кардиотропных аутоантител проводили с использованием стандартных процедур иммуноферментного анализа. Непосредственно перед исследованием сыворотку крови обследуемых детей разводили 1:200 0,15М NaCI, вносили в лунки ИФА-планшетов (Нунк-Максисорб, Дания) с предварительно сорбированными антигенами, инкубировали при Т +2...+4° С в течение 14-16 часов, после чего проводили стандартную процедуру ИФА. В качестве

хромагена использовали раствор тетраметилбензидина с Н₂0₂. Регистрацию проводили на длине волны 450 нм с помощью ИФА-анализатора («ЭФОС», Россия). Результаты сывороточной иммунореактивности анализируемых проб, полученные в единицах оптической плотности, пересчитывали по отношению к иммунореактивности сыворотки «внутреннего стандарта» с теми же антигенами и выражали в процентах от уровня реакции стандарта (условные единицы).

Критерии «нормы реакции» по данным лаборатории, были определены с учетом возраста пациентов и представлены следующими диапазонами значений:

-40 ... -10усл.еД. - Для Детей от 2 До 6лет.

-40 ... 0 усл.еД. - Для Детей от 7 До 10 лет

-30 . +10 усл.еД. - Для Детей от 11 До 16 лет.

Определение сывороточного содержания естественных кардиотропных аутоантител и интерпретация полученных результатов проводились согласно требованиям методики группы ЭЛИ-Кардио-Тест и личном участии д.м.н. проф. А. Б. Полетаева.

С целью выявления степени и характера инфицированности детей с НРСиП вирусами семейства Herpesviridae в сыворотке крови 84 пациентов (62 ребенка с НРСиП и 22 ребенка без аритмии) методом иммуноферментного анализа (ИФА) определялись серологические маркеры (уровни антител (АТ) класса IgM и IgG) вирусов простого герпеса 1,2 типов (HSV 1,2 типов), цитомегаловируса (CMV), Эпштейн-Барр вируса (EBV), вируса герпеса 6 типа (ННѴ6)). Исследования проводились на базе лаборатории МИЦ «Иммункулус» (Москва).

У всех детей были определены уровни антител (АТ) класса IgM и IgG к HSV 1,2 типов, CMV, IgM к капсидному антигену (VCA) EBV и IgG к ядерному антигену (EBNA) EBV, IgG HHV6.

Применялись тест-системы «Вектор Бест» г. Новосибирск. Данные тест системы (вектоВПГ-IgM, вектоВПГ-IgG-стриn; вектоЦМВ-IgM (основной реагент - рекомбинантные антигены ЦМВ), вектоЦМВ-IgG-стрип (основной реагент - очищенный рекомбинантный антиген ЦМВ); вектоВЭБ-VCA-IgM (основной реагент - очищенный рекомбинантный белокѴСА-18), вектоВЭБ- NA-IgG IgM (основной реагент - очищенный рекомбинантный белок ЕВЫА- 1р72); вектоННѴ-6-IgG (основной реагент - очищенные рекомбинантные белки р41 и р100)) предназначены для выявления соответствующих иммуноглобулинов в сыворотке (плазме) крови человека и могут быть использованы для диагностики первичной и рецидивирующей герпетической инфекции.

Суть процесса:

На первой стадии процесса образцы инкубируются в лунках планшета с иммобилизированными антигенами. Антитела связываются с антигенами, несвязавшийся материал удаляется отмывкой. Связавшиеся АТ выявляют при инкубации с конъюгатом АТ к АГ сыворотки с пероксидазой хрена. После второй отмывки количество связавшегося конъюгата определяют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы - перекиси водорода и хромогена - тетраметилбензидина. Реакцию останавливают добавлением стоп-реагента и измеряют оптическую плотность.

Для большей достоверности все исследования были поставлены в дублях.

Методика:

Приготовление реагентов:

После 30 минутной выдержки при комнатной температуре, цефленовый пакет со стрипами вскрывается, после чего стрипы готовы к использованию.

Исследуемые сыворотки разводятся в 10 раз готовым раствором для разведения сывороток (РРС). Для этого в лунки вспомогательного планшета вносится по 90 мкл раствора для разведения сывороток и добавляется по 10

мкл цельной сыворотки, при тщательном перемешивании, при этом малиновый цвет раствора меняется на желтый.

Для отмывки планшетов в соответствие с инструкцией готовится необхоДимое количество фосфатного буфера (ФСБ-Т).

Для приготовления раствора конъюгата (РК) используются раствор Для развеДения конъюгата (РРК) и конъюгат, соотношение которых, указано в инструкции.

Для приготовления раствора тетраметилбензиДина (раствор ТМБ) в соответствующих пропорциях соеДиняется концентрат ТМБ и субстратный буферный раствор (СБР).

В лунку А-1 планшета с иммобилизированным антигеном вносят 100мкл РРС. Лунка А-1 является контролем поглощения раствора ТМБ. В лунки В-1, С-1 и D-1 вносится по 100 мкл отрицательного контрольного образца инактивированного (К^-), в лунки и Е-1 и F-1 вносится по 100 мкл положительного контрольного образца инактивированного (К⁺ ). В остальные лунки вносится по 90 мкл РРС и по 10 мкл преДварительно развеДенных исслеДуемых сывороток. Перемешивание осуществляется пипетированием. Закрытый пленкой планшет инкубируется при t(37.5±0.5)°C в течение 30±3 мин. После окончания инкубации стрипы необхоДимо промыть. Используя вошер, осуществляется 5-кратная отмывка в растворе ФСБ. В кажДую лунку стрипа кроме А-1 вносится по 100 мкл раствора конъюгата, в лунку А-1 вносится 100мкл РРК. Закрытый пленкой планшет инкубируется при t(37.5±0.5)°C в течение 30±3 мин. По окончании инкубации необхоДимо повторить 5-кратную отмывку планшета. В кажДую лунку вносится по 100 мкл ТМБ и инкубируется в темноте 25 мин. при 18-25°С. Реакция останавливается Добавлением в лунки стоп-реагента.

Результаты ИФА регистрируются с помощью спектрофотометра. При этом измеряется оптическая плотность в Двухволновом режиме: основной

фильтр - 450нм, рефренс-фильтр - в Диапазоне 620-650 нм. Калибровка спектрофотометра осуществлялась по воздуху.

Методика выполнения ИФА с применением тест-систем «Вектор Бест» идентична для всех типов герпесвирусов. Оценка же результатов зависит от типа вируса.

Для того чтобы проводить оценку результатов, необходимо было удостовериться в корректности проведенного исследования. Качество тест- системы считается удовлетворительным, если оптическая плотность (ОП) контроля поглощения без конъюгата (лунка А-1) не превышает 0.1 о.е., (оптических единиц) среднее значение ОП в лунках с отрицательным контрольным образцом (ОПср К^- ) не превышает 0.250 о.е. ( для ВПГ IgG 0.20 о.е.), среднее значение ОП в лунках с положительным контрольным образцом (ОПср К⁺ ) не менее чем в три раза превышает ОПср К^-.

При оценке корректности проведения исследования все пробы были признаны удовлетворительными.

Для оценки результатов анализов вычисляют контрольный уровень оптической плотности ОПкрит. Для каждого типа вируса ОПкрит определяется по соответствующей формуле:

HSV 1,2 - IgM ОПкрит = ОПср К^- + 0.20

Положительными считают пробы с ОП>ОПкрит +10% Отрицательными считают пробы с ОПОПкрит +10%.

Отрицательными считают пробы с ОП0.9*ОПкрит

Отрицательными считают пробы с ОП0.9*ОПкрит

Отрицательными считают пробы с ОП