3.2.2. Противоопухолевые препараты

Довольно большую группу химиотерапевтических средств в на­стоящее время составляют противоопухолевые препараты

Наряду со специфическим воздействием на опухолевые клетки эти препараты, к сожалению, влияют и на здоровые ткани и системы орга­низма, вызывая развитие побочных эффектов.

Доклиническое токсикологическое исследование нового вещества с противоопухолевой активностью должно проводиться с учетом извест­ных токсических эффектов препаратов, принадлежащих к той же группе по механизму действия.

Исходя из химической структуры, источников получения и ме­ханизма действия, противоопухолевые препараты делятся на следу­ющие группы [37].

I. Алкилирующие вещества.

II. Антиметаболиты.

III. Синтетические противоопухолевые препараты разных хими­ческих групп.

IV Алкалоиды и другие вещества растительного происхождения, оказывающие цитостатическое действие.

V. Противоопухолевые антибиотики.

VI. Ферменты, применяемые для лечения онкологических забо­леваний.

VII. Интерфероны и интерлейкины.

VIII. Гормональные препараты и их антагонисты, применяемые преимущественно при лечении онкологических заболеваний.

Методические указания по изучению общетоксического действия противоопухолевых фармакологических веществ, составленные Ми­хайловой Л.М. и соавт., содержат требования к такого рода иссле­дованиям. Основной особенностью этой группы препаратов авторы считают двухэтапность доклинического токсикологического иссле­дования [114]:

I этап, предварительный, представляет систему токсикологической программы под названием "мини-токси", предусматривающую решение вопроса о целесообразности и перспективности дальнейшего токсико­логического изучения нового препарата и продвижения его в клинику. При изучении токсичности по программе "мини-токси" препарат харак­теризуется по 4 основным тестам:

1) изучение острой токсичности,

2) изучение местнотканевых реакций,

3) изучение лимитирующей токсичности,

4) биологическая стандартизация по токсичности и пирогенности.

В результате этих исследований препарат получает основную токси­кологическую характеристику "токсикологический паспорт", в котором заложены количественная и качественная оценки нового противоопухо­левого препарата.

II этап представляет собой расширенное исследование токсичности по "полной программе", предусматривающее доклиническое изучение безвредности лекарственных препаратов в соответствии с требованиями Минздрава России [113].

Полностью поддерживая постулаты, изложенные в представленных Методических указаниях [114], хотелось бы остановиться на некоторых особенностях изучения токсичности этой группы лекарственных средств.

Прежде всего, при изучении токсичности противоопухолевых препа­ратов необходимо отметить влияние их на органы и системы организма, повреждение которых приводит животных к гибели в отдаленные сроки после однократного введения. В связи с этим при изучении острой ток­сичности данных препаратов на мелких лабораторных животных нельзя ограничиваться только показателем ЛД₅₀. Всех животных необходимо подвергать некропсии с обязательным гистологическим исследованием внутренних органов. Токсичность этой группы соединений желательно оценить и на крупных лабораторных животных при однократном при­менении. Сравнение результатов, полученных в острых опытах на мел­ких и крупных лабораторных животных, поможет более точно прогно­зировать проявление токсических эффектов в клинике.

Примером такого подхода к токсикологическому исследованию но­вого противоопухолевого препарата может быть доклиническое изуче­ние спиробромина, предложенного ЦХЛС-ВНИХФИ в качестве проти­воопухолевого средства [112].

Изучение токсичности спиробромина при однократном введении было проведено на мышах, крысах, кроликах, собаках и кошках.

LD₅₀ для мышей составляет 710,0 (680,7-г740,5) мг/кг, для крыс -820 (711,2^-945,5) мг/кг.

Изменения в поведении и общем состоянии животных отмечали по­сле введения препарата в дозе 600-700 мг/кг.

Срок наступления летального исхода определялся дозой спироб- ромина. Интоксикация развивалась уже в первый день после введения препарата в высоких дозах, и животные погибали через 2-3 сут. Оста­новка дыхания предшествовала остановке сердца. У животных, павших в течение 5-12 дней после однократного введения препарата, наблюда­лись снижение массы тимуса, селезенки, семенников и увеличение над­почечных желез; макроскопическое исследование выявило гиперемию и кровоизлияния по ходу желудочно-кишечного тракта. Гистологическое исследование внутренних органов показало, что количество жировых клеток в красном костном мозге увеличено, в селезенке - ретикулярная гиперплазия и сужение реактивных центров, мозговой и корковой слои тимуса плохо различимы, эпителиальные клетки увеличены в размере.

У кроликов после однократного внутривенного введения спиробро- мина в дозе 300 мг/кг через 2-5 дней развивалась адинамия. Масса тела животных уменьшалась на 300-400 г. Через 2-3 нед животные возвра­щались к исходному состоянию.

Собаки переносили однократное внутривенное введение спиробро- мина в дозах до 50 мг/кг без видимых изменений в поведении и состоя­нии. Однако проведенные исследования состояния сердечнососудистой системы у собак показали значительное снижение артериального давле­ния и синусовую брадикардию после однократного введения в дозе 50 мг/кг. При повторном введении препарата кроме брадикардии наблюда­лись уменьшение вольтажа желудочкового комплекса и инверсия зуб­цов Т и Р.

Учитывая кардиотропность спиробромина, его влияние на сердечно­сосудистую систему было изучено на кошках. У наркотизированных кошек при внутривенном введении спиробромина в дозе 10-25 мг/кг отмечено непродолжительное снижение артериального давления на 10- 15 мм рт.ст. Введение препарата в дозе 50 мг/кг приводило к снижению артериального давления на 25- 40 мм рт.ст. Через 15-20 мин уровень давления нормализовался.

При изучении хронической токсичности потенциального проти­воопухолевого препарата необходим полный объем исследований со­стояния гомеостаза животных - с обращением особого внимания на те органы или системы, патология которых была выявлена при изучении его острой токсичности.

Противоопухолевые препараты часто обладают кумулятивным эф­фектом, поэтому необходимо изучение их материальной и функ­циональной кумуляции при оценке токсичности нового вещества.

Кроме того, противоопухолевые препараты, как правило, при-

меняются в комплексе с другими лечебными мероприятиями, такими как хирургическое лечение и лучевая терапия, что может усилить ток­сические эффекты препаратов, выявленные при изучении на интактных животных. Все эти моменты необходимо учитывать при решении во­проса о применении препаратов в онкологической практике.

Особую роль играет совместимость лекарственных препаратов при комбинации нескольких противоопухолевых средств. Поскольку мета­болизм многих лекарственных препаратов происходит в печени, особое внимание при изучении токсичности нового противоопухолевого веще­ства должно быть уделено его влиянию на функциональное состояние печени у экспериментальных животных.

Так, при биохимическом анализе сыворотки крови крыс, в течение 24 дней получавших спиробромин в дозе 26 мг/кг (1/32 LD₅₀), было об­наружено повышение активности щелочной фосфатазы и трансаминаз. Препарат в дозе 52 мг/кг (1/16 LD₅₀) кроме указанных реакций изменял содержание сахара в крови. Через месяц после отмены препарата все биохимические показатели крови нормализовались.

В сыворотке собак, получавших спиробромин, наряду с измене­ниями, обнаруженными у крыс, было отмечено в крови повышенное со­держание холестерина и сниженное содержание белка за счет а- фракции.

Исследование влияния спиробромина на неспецифические фер­ментные системы печени крыс с помощью гексеналовой пробы выяви­ло, что повторное введение препарата в высоких дозах способствует существенному усилению действия гексенала (табл.

Таблица 23 - Влияние внутривенного введения крысам спиробромина на продолжительность сна, вызванного гексеналом

Несмотря на то, что положительная гексеналовая проба и другие из­менения в биохимических показателях крови отмечались у животных при введении достаточно высоких доз препаратов, влияние спиробро­мина на функциональное состояние печени необходимо учитывать при совместном применении этого препарата с другими лекарственными средствами.

При изучении токсичности новых потенциальных противоопу­холевых препаратов следует особое внимание обращать на их местно­раздражающее действие. Являясь цитостатиками, противоопухолевые препараты могут вызывать повреждение тканей в области введения. Иногда эти свойства используют для местного разрушения опухоли. Однако на доклиническом токсикологическом этапе исследований не­обходимо изучить все возможные последствия такого воздействия.

Иллюстрацией вышесказанному служат наши исследования проспи- диновой мази [47].

Проспидин является цитостатиком, нашедшим применение в качест­ве противоопухолевого средства при лечении рака гортани, глотки, па- пилломатоза верхних дыхательных путей и других злокачественных но­вообразований [173].

Вначале проспидин применялся в виде растворов для паренте­рального или местного применения для обкалывания новообразования. Затем была разработана новая лекарственная форма проспидина в виде мази 50% концентрации.

Изучение на кроликах местного и резорбтивного действия про- спидиновой мази при применении в разных дозах в течение месяца по­казало, что на коже в месте аппликации мази со 2-6-го дня ее при­менения развивалась гиперемия, переходящая в некроз. Скорость раз­вития некроза находилась в прямо пропорциональной зависимости от величины дозы. При микроскопическом исследовании пораженных уча­стков кожи через 1 сут после заключительной аппликации мази у всех подопытных животных отмечено отторжение некротизированного эпи­дермиса мышечных волокон, отмечались обширные очаги лейкоцитар­ной инфильтрации.

После прекращения применения препарата происходило отторжение струпа и полная регенерация эпидермиса. Полная эпителизация кожи с восстановлением волосяного покрова происходила в течение 6-8 нед. У животных, получавших препарат в максимальной дозе (100 мг/кг), через 2 мес после окончания применения мази на коже оставался нежный рубчик или легкая гиперпигментация.

Микроскопическое исследование кожи через 2 мес после окончания курса применения проспидиновой мази показало полную регенерацию

эпителиального покрова, соответствующего структуре многослойного плоского эпителия.

Проспидиновая мазь во всех изученных дозах при длительном мест­ном применении не оказывала токсического действия на организм кро­ликов, что было подтверждено клиническими, лабораторными и пато­морфологическими исследованиями.

Однако не всегда местно-раздражающее действие при применении противоопухолевых препаратов бывает обратимым.

При токсикологическом изучении противоопухолевого препарата спиробромина было показано, что его местно-раздражающее действие при внутривенном введении невелико и проявляется только при дли­тельном введении препарата в высоких концентрациях. Однако когда встал вопрос о возможности интравагинального использования спи­робромина в клинике, было изучено его местное воздействие при ин- травагинальном введении крольчихам в виде суппозиториев.

Проведенные исследования показали, что такой способ применения спиробромина вызывает в слизистой оболочке влагалища развитие нек­роза. При патоморфологическом исследовании отмечено, что изменения во влагалище развиваются даже после однократного введения спироб­ромина. При курсовом применении в патологический процесс вовлека­ется матка. Через месяц после окончания интравагинального введения спиробромина сохраняются изменения в виде расширения полости мат­ки, отека, гиперемии слизистой оболочки, кровоизлияний, скопления серозной жидкости в полости матки. Такое местное воздействие проти­воопухолевого препарата должно рассматриваться как опасное и за­прещающее его использование при данном методе применения.

Изучение токсичности воспроизведенных противоопухолевых пре­паратов, так называемых генериков, некоторые исследователи рекомен­дуют проводить по укороченной схеме [114].

Хотелось бы подробнее остановиться на термине "укороченная схе­ма" для группы противоопухолевых средств, поскольку в настоящее время в России воспроизводится большое количество генериков. Ос­новная задача токсикологической оценки генериков сводится к тому, чтобы показать его идентичность прототипу по показателям токсично­сти. В связи с этим необходимо проводить сравнительное изучение ост­рой и субхронической токсичности генерика и его прототипа. Учиты­вая, что большинство воспроизводимых противоопухолевых препаратов обладает высокой токсичностью, схема изучения субхронической ток­сичности должна включать оценку всех токсических свойств, известных для препарата, зарегистрированного в России. Только идентичность токсических свойств генерика и зарегистрированного препарата дает

основание передать генерик в клинику.

При изучении субхронической сравнительной токсичности должны быть использованы дозы, вызывающие токсические эффекты.

При воспроизводстве противоопухолевых препаратов, особенно за­рубежных, нередко допускаются отличия в составе лекарственной фор­мы в силу тех или иных причин, что может привести к изменению ток­сических свойств генерика.

Особенно важно это иметь в виду в тех случаях, когда генерик вос­производится другим методом синтеза. Минорные включения (остатки растворителя, примеси и т.п.) могут играть существенную роль при курсовом применении препарата, поэтому длительность введения его в субхроническом эксперименте не должна быть менее 2 нед или не­скольких более коротких курсов в соответствии с инструкцией по при­менению препаратов в клинике. Оценка состояния гомеостаза экспери­ментальных животных должна включать гематологические, биохимиче­ские и обязательно гистологические методы исследования. Особое вни­мание при изучении токсичности генериков должно быть уделено орга­нам-мишеням или системам-мишеням, поскольку эти органы и патоло­гические процессы, развивающиеся в них, описаны в литературе для препарата, который воспроизвели. Учитывая особенности группы про­тивоопухолевых средств, животные должны быть подвергнуты эвтана­зии не только после окончания введения препаратов, но и через 1-2 нед после его отмены. Оценка степени обратимости выявленной патологии также очень важна при решении вопроса о соответствии генерика ана­логу, зарегистрированному в России.

Примером такого подхода может быть наше токсикологическое ис­следование воспроизведенного цисплатина в сравнении с платидиамом, зарегистрированным в России в качестве противоопухолевого средства.

Цисплатин избирательно и длительно ингибирует синтез ДНК по ал­килирующему типу, в меньшей степени синтез РНК и белка, в результа­те чего нарушается жизнедеятельность клеток и блокируется их мито­тическое деление. Высокочувствительны к препарату ядра гиперплази­рованных (опухолевых) клеток, но вместе с тем препарат способен взаимодействовать с нуклеопротеидами клеточных ядер нормальных клеток, особенно органов, непосредственно контактирующих с данным веществом, а именно почек. Патологические процессы, развивающиеся в почках при введении цисплатина, являются основным фактором, ли­митирующим его применение [153].

При создании цисплатина были использованы собственный хи­мический синтез и лекарственная форма, несколько отличающаяся от зарубежной, хотя и не принципиально.

Исследования токсичности этого препарата были проведены на не­скольких видах животных в сравнении с платидиамом (Чехия), зареги­стрированном в России [112].

Изучение острой токсичности на мышах показало равную токсич­ность в группах, получавших цисплатин и платидим в/в однократно. LD₅₀ для цисплатина составляла 12,5 мг/кг, для платидиама- 13 мг/кг.

При изучении хронической токсичности цисплатина его параллельно с платидиамом вводили в/в струйно в дозах 1, 2 и 5 мг/кг 1 раз в день в течение 5 дней. Таких пятидневных курсов было 3 с недельным интер­валом после каждого курса. Кроликам препараты также вводили в/в в дозе 0,5 мг/кг в течение 5 дней. Таких курсов было проведено 2 с не­дельным интервалом между ними. Исследования, проведенные на 70 крысах и 15 кроликах, показали, что при введении как цисплатина, так и платидиама состояние животных находилось в прямой зависимости от дозы введенных препаратов. При введении препаратов в дозе 2 мг/кг состояние животных начало ухудшаться со 2-го курса введения (шерсть приобрела взъерошенный, тусклый вид, диурез снизился, часть живот­ных погибла).

У крыс, получавших препараты в дозе 5 мг/кг, явления интоксикации начали проявляться после 2-3 введений. После 5-го введения часть жи­вотных этой группы была забита, оставшиеся погибли через 1-2 дня.

При вскрытии всех подопытных животных отмечались макро­скопические изменения в почках. Почки имели неоднородный пестрый цвет с желтоватым оттенком и бугристую поверхность. Отмечалось снижение массы селезенки и тимуса.

С помощью гистологических исследований выявлены дистрофи­ческие и некротические изменения в эпителии извитых почечных ка­нальцев со значительным увеличением белковых масс в их просвете. На месте погибших канальцев образовались крупные кисты, наполненные серозной жидкостью. Боуменово пространство в ряде случаев расшире­но и содержит серозную жидкость. Отмечаются скопление гистоцитар- ных элементов, разрастание соединительной ткани. Просветы прямых канальцев заполнены белковыми массами.

В тонком кишечнике наблюдаются некротические изменения эпите­лия ворсинок и обнажение собственного слоя слизистой оболочки. В тимусе - гипоплазия, в костном мозге - аплазия, выраженная в большей степени у самок. В нейронах головного мозга - дегенеративные измене­ния. На фоне гидропического набухания клеток наблюдается растворе­ние Нислевой субстанции с выпадением продуктов коагуляции в виде зерен. Гиперхромные ядра приобретают неправильную, чаще угловатую форму. В отдельных клетках ядро увеличено, очень светлое, округлое.

Встречаются клетки-"тени". Все указанные патологические изменения в большей степени выражены у крыс, получавших 3 курса цисплатина в дозе 2 мг/кг. У животных, обследованных через 1 мес после окончания введения препаратов, на фоне еще выраженных патологических изме­нений отмечаются восстановительные процессы.

Степень патологии и ее обратимость были одинаковы в группах жи­вотных, получавших цисплатин и платидиам.

Применение цисплатина и платидиама у кроликов в дозе 0,5 мг/кг в течение 2 нед вызывало развитие патологических процессов только в почках. Основная патология выражалась в дистрофии и десквамации эпителия извитых канальцев. Степень выявленной патологии одинакова в группах кроликов, получавших цисплатин и платидиам.

Таким образом, сравнительное изучение субхронической токсич­ности показывает идентичность воспроизведенного препарата его ана­логу, применяющемуся в клинике по показателю токсичности.

Суммируя данные литературы и результаты собственных много­летних исследований, следует подчеркнуть важность токсикологиче­ского изучения противоопухолевых препаратов на нескольких видах животных, включая собак, а в ряде случаев и кошек. Данные, полу­ченные в экспериментах на животных, позволяют оценить риск воз­никновения нежелательных токсических эффектов у онкологических больных, разработать схему применения препарата, позволяющую сни­зить его токсичность при сохранении высокой противоопухолевой ак­тивности.