Изучение амилоидогенеза in vitro: значение для разработки диагностики и терапии амилоидозов

З.А. Подлубная, А.Г. Бобылёв

Амилоидозы (конформационные болезни) характеризуются неограниченно растущими белковыми отложениями в виде нерастворимых фибрилл (амилоидов) в разных органах и тканях, образующихся в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белков.

Известно более 30 белков, образующих амилоидные фибриллы, таких как т-белок, хантингтин, амилин, Ар-пептиды, а-синуклеин, инсулин, лизоцим, мио- глобин, транстиретин и др. (Uversky, Fink, 2001). Несмотря на различия в белках- предшественниках амилоидов, образуемые ими амилоидные фибриллы имеют общие свойства: Р-складчатую структуру с отдельными P-слоями, ориентированными параллельно главной оси фибриллы; нерастворимость in vivo; специфическое связывание с красителями Конго красным и тиофлавином Т (Klunk et al., 1989; Krebs et al., 2005).

Сокращения: КК - Конго красный; ТИФА - твердофазный иммуноферментный анализ; ТТ - тиофлавин Т; ЭМ - электронная микроскопия; NaFL - фуллеренолат натрия.

щие в основе аномальной агрегации белка in vivo и ее патологического проявления при болезнях, изучены недостаточно. Выяснение молекулярных механизмов амилоидозов, установление природы белков в составе депозитов и их свойств, развитие терапевтических методов лечения и предупреждения этих заболеваний, а также разработка их прижизненной диагностики являются актуальными задачами. Успешное решение этих задач во многом зависит от фундаментальных знаний амилоидогенеза. Одним из эффективных подходов к решению этих задач наряду с другими подходами является изучение амилоидогенеза в системах in vitro: выяснение общих свойств амилоидов, образуемых разными белками, и их различий, открытие факторов, регулирующих их образование и разрушение, их влияния на жизнедеятельность клеток и т.д.

Нами были открыты четыре новых амилоидных белка - цитоскелетные мышечные белки семейства тайтина (Alekseeva et al., 2004). Мы провели in vitro исследования способности этих белков формировать амилоидные агрегаты в сравнении с Ар-пептидами мозга. Эти белки (тайтин, Х-, С-, Н-белки), связанные в саркомере с миозиновыми нитями, играют важную роль в формировании структуры саркоме- ров, механизме сокращения, его регуляции и в процессах сигнализации (Вихлян- цев, Подлубная, 2007). Поскольку, как отмечено выше, разные белки-предшественники амилоидов имеют сходные свойства, то возможны и сходные подходы к разрушению их амилоидов.

В связи с тем, что амилоидные отложения находят в кровеносных сосудах, мы продолжили исследования, направленные на поиск новых амилоидных белков в мышцах, и в частности изучили амилоидные свойства гладкомышечного белка

Рис. 1. Электронные микрофотографии амилоидных агрегатов белков семейства тайтина А - пучки линейных фибрилл Х-белка, сформированные в 25 мМ NaCl, 10 мМ Hepes, pH 7,0. Видны аморфные агрегаты (стрелка) и фибриллы. Б - пучки фибрилл С-белка скелетных мышц кролика, сформированные в растворе, содержащем 0,15 М глицин-KOH, pH 7,5. В - ленточные фибриллы Н-белка скелетных мышц кролика, сформированные в растворе, содержащем 0,05 М MgCl₂, 10 мМ имидазола, pH 7,0. Температура 4-35°С. Негативное окрашивание 2-процентным водным раствором уранилацетата. Шкала 100 нм

смитина (аналога тайтина скелетных и сердечной мышц). Поскольку смитин имеет молекулярную структуру, подобную тайтину скелетных и сердечной мышц (Kim, Keller, 2002), мы предположили, что смитин также может легко формировать амилоиды.

С помощью ЭМ было показано, что смитин способен формировать аморфные агрегаты (Бобылева и др., 2010), а также пучки линейных фибрилл длиной ~0,5 мкм и более, шириной до 100 нм (рис. 2), как и другие известные амилоидогенные белки (Chiti et al., 1999; Goldsbury et al., 2000; O’Nuallain et al., 2004; Uversky, Fink, 2001; Подлубная, Марсагишвили, 2008), в том числе и мышечные белки семейства тайтина.

На рис. 3 приведены пучки линейных амилоидных фибрилл, образуемых АР(1- 42)-пептидом мозга и тайтином. На электронных микрофотографиях видно, что тайтин и АР(1-42)-пептид формируют сходные по структуре пучки амилоидных фибрилл, подобные смитину (рис. 2Б).

Рис. 2. Электронные микрофотографии амилоидных агрегатов смитина (гладкомышечного тайтина)

А - аморфные агрегаты смитина гладких мышц желудка кролика, сформированные в растворе, содержащем 0,05 М глицин-KOH, рН 7,0. Б - пучки линейных фибрилл смитина гладких мышц желудка кролика, сформированные в растворе, содержащем 0,15 М глицина-KOH, рН 7,0. Температура 4°С. Негативное окрашивание 2-процентным водным раствором уранилацетата. Шкала 100 нм

При спектральных исследованиях интенсивность флуоресценции тиофлавина Т в присутствии аморфных агрегатов смитина возрастала в ~2 раза (рис. 4А), а в присутствии пучков смитина в ~10 раз (рис. 4Б) по сравнению с интенсивностью флуоресценции красителя в присутствии этого белка в молекулярной форме.

При измерении спектральных характеристик раствора КК в присутствии аморфных агрегатов и пучков фибрилл смитина наблюдался сдвиг спектра поглощения красителя в длинноволновую область от ~490 нм к ~500 нм (рис. 5), что также является характерной чертой при связывании КК с амилоидами (Klunk et al., 1989).

Рис. 3. Электронные микрофотографии пучков линейных фибрилл Лр(1-42)-пептида мозга и смитина

А - пучки линейных фибрилл Лр(1-42)-пептида мозга, сформированные в растворе 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, pH 7,0.

Рис. 4. Интенсивность флуоресценции тиофлавина Т в присутствии амилоидных агрегатов сми- тина

А - амилоидные аморфные агрегаты смитина (0,05 М глицин-KOH, рН 7,0). Б - пучки амилоидных фибрилл смитина (0,15 М глицин-KOH, рН 7,0)

Проведенные исследования указывают на специфичность связывания красителей с агрегатами смитина, подтверждая их амилоидную природу.

Нами было показано, что смитин образует амилоиды in vitro и, как открытые нами ранее амилоидные белки семейства тайтина, может быть потенциальным участником развития амилоидозов in vivo.

Процессы формирования амилоидных фибрилл разными белками in vitro характеризуются разной скоростью (Kim et al., 2002). Она зависит от состава растворов, температуры, рН, ионной силы и др. Однако наибольшее влияние оказывает, скорее всего, тип вторичной структуры белка. Если белок содержит высокий про-

о 410 450 490 530 570

Рис. 5. Спектры поглощения красителя Конго красного в отсутствие (сплошная линия) и в присутствии (пунктирная линия) амилоидных агрегатов смитина (0,15 М глицин-KOH, рН 7,0)

Длина волны, нм

Рис. 6. Динамика формирования амилоидных агрегатов Х-белка. Электронные микрофотографии амилоидов Х-белка и интенсивность флуоресценции тиофлавина Т в их присутствии

А - аморфные агрегаты Х-белка (4 часа диализа). Б - линейные короткие фибриллы и аморфные агрегаты Х-белка (17 часов диализа). В - спирально скрученные ленточные фибриллы Х-белка (22 часа диализа), сформированные в растворе, содержащем 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, pH 7,0. Негативное окрашивание 2-процентным водным раствором уранилацетата. Шкала 100 нм. Г - скорость образования амилоидных фибрилл Х-белка

цент а-спирали, то требуется трансформация типа «а-спираль - Р-складчатость». При этом in vitro приходится использовать условия, несовместимые с условиями in vivo (денатурирующие вещества, низкие значения рН, высокие температуры, длительная инкубация, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и т.п.). Эти условия приводят к образованию Р-складчатости, характерной для амилоидных фибрилл. Согласно литературным и нашим данным (Марсагишвили, 2007), молекулы белков семейства тайтина уже содержат 90% Р-складчатой структуры, и для них нет необходимости в изменении вторичной структуры, вследствие чего они должны быстро формировать амилоиды in vitro. Образование ими амилоидных фибрилл происходит в мягких условиях (рН 7,0, температура 5-30°С, ионная сила, близкая к физиологической) и быстрее, чем в случае других амилоидных белков (Марсагишвили и др., 2006). Это преимущество и было продемонстрировано нами на примере Х-белка, так как он образует наиболее упорядоченные амилоидные фибриллы (спирально скрученные ленты) и методом электронной микроскопии можно визуально оценить, как происходит процесс фибриллообразования. Параллельно в этих экспериментах динамика образования амилоидных фибрилл Х-белком оценивалась по их связыванию с флуоресцентным красителем ТТ, то есть по увеличению интенсивности флуоресценции красителя при спектрофлуорометрических измерениях (рис. 6). В образцах белка происходило накопление амилоидных фибрилл. Не происходило значительного возрастания интенсивности флуоресценции ТТ в первые часы инкубации (1-4 часа), так как фибриллы еще не были сформированы, а присутствовали только аморфные агрегаты (см. рис. 6А). При дальнейшей инкубации интенсивность флуоресценции ТТ возрастала, что соответствовало образованию амилоидных протофибрилл (см. рис. 6Б), среди которых наблюдались и аморфные агрегаты. После 22 часов интенсивность флуоресценции красителя при связывании со зрелыми фибриллами достигала плато, что согласуется с данными электронной микроскопии, демонстрирующей присутствие хорошо сформированных спирально скрученных ленточных фибрилл Х-белка (см. рис. 6В). Они наблюдаются и после 26 часов диализа.

Накопление амилоидов в клетках и тканях организма может приводить к их гибели, и важно не допустить агрегацию и накопление амилоидов в организме. Поэтому наши дальнейшие исследования были направлены на поиск подходов к разрушению амилоидов и предотвращению их образования.

Для выяснения возможных подходов к разрушению амилоидных фибрилл, образуемых X-белком семейства тайтина в сравнении с АР(1-42) и АР(25-35)-пептидами мозга, было проведено изучение эффекта тетрациклина и фуллерена C₆₀ на структуру их фибриллярных агрегатов (Марсагишвили и др., 2005; Подлубная, Марсагишвили, 2007). Мышечный Х-белок является наиболее удобной моделью для этих экспериментов, благодаря способности строить упорядоченные спирально скрученные ленты, сходные с амилоидными фибриллами Ар-пептидов мозга (рис. 7А, Б).

Нами показано, что антибиотик тетрациклин разрушает фибриллы, формируемые белками семейства тайтина. На снимках видны фрагменты фибрилл Х-белка после действия тетрациклина длиной ~24-64 нм (рис. 8Б) и отдельные молекулы Х-белка. Действие тетрациклина на фибриллы Х-белка подобно его действию на

Рис. 7. Электронные микрофотографии

А, Б - спирально скрученные ленточные фибриллы АР(1-42)-пептида мозга, сформированные в растворе, содержащем 30 мМ КО, 10 мМ имидазола, рН 7,0. Температура 37°С. В - спирально скрученные ленточные фибриллы мышечного Х-белка, сформированные в растворе, содержащем 30 мМ КО, 10 мМ имидазола, рН 7,0. Температура 4°С. Негативное окрашивание 2-процентным водным раствором уранилацетата. Шкала 100 нм

амилоиды Ар-пептида и т-белка при болезни Альцгеймера, на депозиты хантинг- тина при болезни Хантингтона, а также на амилоидные фибриллы прионного белка (Forloni et al., 2001).

В последнее время фуллерены (рис. 9) рассматривают как лекарственные препараты (Пиотровсий, Киселев, 2006), в том числе и для лечения нейродегенеративных болезней. Важность использования фуллерена C₆₀ в этих исследованиях обусловлена наличием у него таких положительных свойств, как нейропротекция и сильные антиоксидантные свойства (Dugan et al., 1996; Chiang et al., 1995; McEwen et al., 1992). Невизуальным методом показано ингибирующее влияние производного фуллерена C₆₀ (1,2-(диметоксиметано)фуллерен) на фибриллогенез АР(11-25)- пептида и АР(1-40)-пептида in vitro (Kim, Lee, 2003).

Рис. 8. Электронные микрофотографии

А - спирально скрученные ленточные фибриллы Х-белка, сформированные в растворе, содержащем 30 мМ КО, 10 мМ имидазола, рН 7,0. Б - фрагменты фибрилл Х-белка после действия тетрациклина. Весовое соотношение белка и тетрациклина 1:1. Температура 4°С. Негативное окрашивание 2-процентным водным раствором уранилацетата. Шкала 100 нм

Рис. 9. Структура фуллерена С₆₀

Молекула имеет форму правильного усеченного икосаэдра, в котором атомы углерода располагаются на сферической поверхности в вершинах 20 правильных шестиугольников и 12 правильных пятиугольников, так что каждый шестиугольник граничит с 3 шестиугольниками и 3 пятиугольниками, а каждый пятиугольник граничит только с шестиугольниками. Диаметр молекулы С₆₀ равен примерно 0,71 нм при молекулярной массе 720 дальтон

Биологическое действие фуллеренов обуславливается прежде всего тем, что, несмотря на большое количество атомов, молекула фуллерена компактна. Диаметр молекулы С₆₀ равен —0,71 нм (при молекулярной массе 720 дальтон), что сравнимо с размерами таких органических молекул, как бензол, фенилаланин и меньше размера более сложных молекул, таких как АМФ (Пиотровский, 2005).

Однако серьезным осложняющим фактором при исследовании биологических свойств самого фуллерена и большинства его производных является их практически полная нерастворимость в полярных растворителях (Beck, Mandy, 1997; Ruoff et al., 1993; Sivaraman et al., 1992). Для решения этой проблемы используются следующие подходы: стабильные коллоидные растворы фуллеренов в воде (Andrievsky et al., 2009), нековалентные комплексы фуллеренов с гидрофильными органическими молекулами, в том числе с полимерами, синтезированные водорастворимые производные фуллеренов.

Эти подходы имеют свои достоинства и недостатки. В коллоидных растворах фуллеренов, как и в некоторых нековалентных комплексах, молекулы фуллере- на находятся в виде ассоциатов (Пиотровский, 2005). Присоединение радикала к молекуле фуллерена приводит к изменению природы самого фуллеренового ядра, причем чем больше степень замещения, тем более выражено это изменение (Сидоров, Болталина, 2002). Поэтому физические, химические и биологические свойства фуллеренов, а также их ковалентных производных могут принципиально различаться. Кроме того, введение объемных заместителей может стерически блокировать само фуллереновое ядро, что также скажется на его способности проявлять собственные биологические свойства.

Методом ЭМ мы впервые продемонстрировали антиамилоидогенную способность гидратированного фуллерена С₆₀ (С₆₀ HyFn) по отношению к фибриллам АР(25-35)-пептида, АР(1-42)-пептида и Х-белка (Podlubnaya et al., 2006; Podolsky et al., 2007; Подлубная, Марсагишвили, 2007; Марсагишвили и др., 2007; Подлуб- ная и др., 2006; Макарова и др., 2007; Podlubnaya et al., 2007). Добавление C₆₀ HyFn к спирально скрученным лентам Х-белка в весовом соотношении 1:2 приводило к их декорации сферическими частицами фуллерена, уменьшению длины и ширины лент (данные не показаны). Более того, в присутствии С₆₀ HyFn Х-белок в молекулярной форме не формировал амилоидных фибрилл. Добавление С₆₀ HyFn к амилоидам Ар(25-35)-пептида в молярном отношении 15:6 и инкубация их в течение 24 часов при 37°С приводит к декорации его спирально скрученных лент сферическими частицами фуллерена, уменьшению их диаметра, длины и количества (рис. 10Д) по сравнению с контролем (рис. 10А, Б). Мы наблюдали аналогичный эффект C₆₀ HyFn и на амилоиды АР(1-42)-пептида. Следует отметить, что тетрациклин и C₆₀ HyFn не только разрушают амилоиды Х-белка и Ар-пептидов, но и предотвращают их образование, что важно в терапии амилоидозов. Полученные результаты подтверждают наше предположение о возможности сходных подходов к разрушению амилоидов Х-белка семейства тайтина и Ар-пептидов мозга в связи с их общими структурными свойствами. Эти подходы могут быть предварительно разработаны на системах саркомерных белков семейства тайтина в силу их достаточных количеств и экономии финансовых затрат на исследования в сравнении с затратами на амилоидные пептиды. Нужно отметить и интенсификацию исследований вследствие уменьшения временных затрат на формирование амилоидов белками семейства тайтина. Следует также указать, что антиамилоидогенная активность фуллеренов, наноразмерных частиц, открывает перспективы для разработки новой медицинской нанотехнологии для терапии амилоидозов, и в частности для болезни Альцгеймера. Полученные нами данные показали, что введение в мозг крысам C₆₀ HyFn положительно влияет на когнитивные процессы в норме. Этот результат свидетельствует об отсутствии нейротоксичности фуллерена С₆₀. Более того, имеется соответствие между описанным выше антиамилоидогенным действием C₆₀ HyFn на амилоиды ЛР(25-35)-пептида in vitro и его способностью предотвращать нарушение решения когнитивных вероятностных задач у экспериментальных животных, индуцированное ЛР(25-35)-пептидом (Podolsky et al., 2007). Эти данные позволяют рассматривать C₆₀ HyFn как потенциальные лекарства при лечении ами- лоидозов. Однако этому препятствует его низкая растворимость в воде. В связи с этим нами были исследованы антиамилоидные свойства ряда водорастворимых производных фуллерена C₆₀ (натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена C₆₀ (C₆₀Cl(C₆H₄CH₂COONa)₅), фуллеренолата натрия (NaFL), С₆₀-алани- на и нитроксипроизводных фуллерена C₆₀ (C^-КО^пролина, C^-fNO^-пролина, ^-КО^пролин-КО^, а также комплексов фуллерена C₆₀ с поливинилпирролидо- ном (C₆₀/nBn) (м.м. ПВП 10000 и 25000).

Методом ЭМ мы исследовали антиамилоидные свойства C₆₀Cl(C₆H₄CH₂COONa)₅ (рис. 11А) (Марсагишвили и др., 2009; Бобылёв и др., 2009). Данное производное

Рис. 10. Электронные микрофотографии ЛР(25-35)-пептида в присутствии и отсутствие гидратированного фуллерена C₆₀

Л, Б - амилоидные спирально скрученные ленточные фибриллы. В - амилоидные листовые структуры ЛР(25-35)-пептида, инкубированного в течение 24 часов при 35°C. Г - сферические агрегаты гидратированного фуллерена и их скопления. Д - инкубация ЛР(25-35)-пептида с гидратированным фуллереном C₆₀ в молярном соотношении 6:15 (стрелками показаны тонкие фибриллы). Негативное окрашивание 2-процентным водным раствором уранилацетата. Шкала 100 нм

Рис. 11. Структура исследованных нами растворимых производных фуллерена C₆₀ А - натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена С₆₀ (C₆₀Cl(C₆H₄CH₂COONa)₅). Б - комплекс фуллерена C₆₀ с поливинилпирролидоном (С₆₀/ПВП). В - фуллеренолат натрия (NaFL). Г - С₆₀-Ы0₂-пролин. Д - С₆₀-(Ы0₂)₂-пролин. Е - С₆₀-К0₂-пролин-ЫО₂. Ж - С₆₀-аланин

фуллерена C₆₀, в отличие от C₆₀ HyFn, хорошо растворяется в полярных растворителях и не образует агрегаты in vitro.

Добавление C₆₀Q(C₆H₄CH₂COONa)₅ к спирально скрученным ленточным амилоидным фибриллам Х-белка приводило к их полному разрушению. Производное фуллерена C₆₀Cl(C₆H₄CH₂COONa)₅ не только разрушало амилоидные фибриллы, но и предотвращало их образование. Аналогичный эффект это производное оказывало на амилоидные фибриллы АР(1-42)-пептида мозга. В ходе ЭМ-исследования было показано, что данное производное фуллерена разрушало фибриллы АР(1-42)- пептида мозга и предотвращало образование новых фибрилл. Это важно, поскольку современная превентивная стратегия медицины направлена на предотвращение перехода мягких когнитивных нарушений и начальных форм болезни Альцгеймера в развитые формы этой болезни.

Рис. 12. Электронные микрофотографии AP(1-42) в присутствии и отсутствие NaFL А - NaFL. Б - спирально скрученные ленточные фибриллы АР(1-42)-пептида, сформированные в растворе, содержащем 30 мМ KCI, 10 мМ имидазола, рН 7,0. АР(1-42)-пептид в присутствии добавленного до (В) и после (Г) формирования амилоидных фибрилл. Инкубация 24 ч при 37°

Электронно-микроскопическое исследование антиамилоидного действия NaFL (С₆₀ (NaJC₆₀(OH)₃₀])) (рис. 11В) на фибриллы Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга показало, что он, так же как C₆₀Cl(C₆H₄CH₂COONa)₅, разрушал зрелые фибриллы АР(1-42)-пептида мозга, а также предотвращал их образование (рис. 12В, Г) (Bobylev et al., 2011). Аналогичный эффект NaFL оказывал на амилоиды Х-белка (Бобылев, 2011).

Антиамилоидный эффект на исследуемые фибриллы был выявлен у С₆₀/ПВП (м.м. ПВП 10000 и 25000) (рис. 13) (Бобылёв и др. 2009). Следует отметить, что, по данным электронной микроскопии, С₆₀/ПВП в солевом растворе образует сферические агрегаты (см. рис. 13А), подобные агрегатам C₆₀HyFn. Однако, в отличие от них, агрегаты С₆₀/ПВП имеют меньший диаметр (~5-30 нм) и количество этих агрегатов значительно меньше в поле зрения, чем у C₆₀HyFn.

Исследование антиамилоидных свойств С₆₀-аланина (см. рис. 11Ж) и нитрок- сипроизводных фуллерена C₆₀ (С₆₀-К0₂-пролин (см. рис. 11Г), C^-CNO^-пролин (см. рис. 11Д), C₆₀-NO₂-пролин-NO₂ (см. рис. 11Е)) показало, что C^-КО^пролин- NO₂ оказывал эффективное антиамилоидное действия на амилоидные фибриллы исследуемых белка и пептида (Бобылев и др., 2010а). С₆₀-К0₂-пролин и C₆₀- (NO^-пролин разрушали амилоиды не так эффективно, как ^-КО^пролин-КО^ C₆₀Cl(C₆H₄CH₂COONa)₅, NaFL и С₆₀/ПВП (Бобылев, 2011). Согласно ЭМ-наблюдениям, добавление C^-аланина, C₆₀-NO₂-пролина и C₆₀-(NO₂)₂-пролина к амилоидным фибриллам Х-белка и АР(1-42)-пептида приводило к снижению их количества

Рис 13. Электронные микрофотографии Х белка и АР(1-42)-пептида в присутствии и отсутствие

СТПВП

60

А - С₆₀/ПВП. Б - Х-белок в присутствии С₆₀/ПВП, добавленного до формирования амилоидных фибрилл. В - Х-белок в присутствии С₆₀/ПВП, добавленного после формирования амилоидных фибрилл. Весовое соотношение Х-белка и С₆₀/ПВП 1:1. Г - АР(1-42)-пептид в присутствии С₆₀/ПВП, добавленного до формирования амилоидных фибрилл. Д - АР(1-42)-пептид в присутствии С₆₀/ПВП, добавленного после формирования амилоидных фибрилл. Весовое соотношение АР(1-42)-пептида и С₆₀/ПВП 1:1. Инкубация 24 ч. Негативное окрашивание 2-процентным водным раствором уранилаце- тата. Шкала 100 нм относительно контроля, а также к уменьшению их длины (рис. 14Б, Г). Зрелых фибрилл в данных образцах не наблюдалось. Также было обнаружено, что ^₀-NO₂- пролин и С₆₀-^0₂)₂-пролин в солевом растворе образуют агрегаты диаметром до 100 нм и более. Из полученных нами ЭМ-данных следует, что большинство исследованных производных фуллерена С₆₀ и его комплексов разрушают амилоидные фибриллы мышечного Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга. При этом действие одного и того же исследованного вещества на фибриллы белка и пептида сходно. Однако действие на амилоидные фибриллы исследуемого белка и пептида разных производных фуллерена С₆₀, по данным электронной микроскопии, не одинаковое. NaFL разрушает амилоидные фибриллы Х-белка и АР(1-42)-пептида более эффективно (см. рис. 12), чем, например, С₆₀-Ы0₂-пролин (см. рис. 14) при одной и той же концентрации.

Рис 14. Электронные микрофотографии Лр(1-42)-пептида и Х-белка в присутствии и отсутствие С₆₀-ЫО₂-пролина

А - Лр(1-42)-пептид в присутствии С₆₀-ЫО₂-пролина, добавленного до формирования амилоидных фибрилл. Б - Лр(1-42)-пептид в присутствии С₆₀-ЫО₂-пролина, добавленного после формирования амилоидных фибрилл. В - Х-белок в присутствии С₆₀-ЫО₂-пролина, добавленного до формирования амилоидных фибрилл. Г - Х-белок в присутствии С₆₀-ЫО₂-пролина, добавленного после формирования амилоидных фибрилл. Весовое соотношение Х-белка, Лр(1-42)-пептида и C₆₀-NO₂- пролина 1:1. Инкубация 24 ч. Негативное окрашивание 2-процентным водным раствором уранилаце- тата. Шкала 100 нм

Таким образом, электронная микроскопия - многообещающий метод тестирования эффективности лекарственных препаратов для терапии болезни Альцгеймера.

Следующей нашей задачей было изучить антиамилоидные свойства исследованных веществ с помощью флуоресцентного анализа.

Ряд авторов, изучающих антиамилоидные свойства разных веществ, используют флуоресцентный анализ (Conway et al., 2001; Kim et al., 2005; Byeon et al., 2007; Reinke et al., 2007; Akaishi et al., 2008; Byun et al., 2008), в основе которого лежит свойство ТТ взаимодействовать с амилоидными фибриллами. При этом взаимодействии происходит увеличение интенсивности флуоресценции красителя при спектрофлуориметрических измерениях. Было показано, что причиной возрастания интенсивности флуоресценции ТТ при его связывании с амилоидными фибриллами является жесткость окружения, препятствующая повороту бензтиа- зольного и аминобензольного колец молекулы красителя друг относительно друга в возбужденном состоянии. Благодаря таким уникальным флуоресцентным свойствам ТТ широко используют при изучении амилоидогенеза in vitro.

При попытке исследовать антиамилоидный эффект C₆₀ HyFn, С₆₀/ПВП, C₆₀- (NO^-пролин, С₆₀^О₂-пролин и С₆₀-аланин на фибриллы мышечного Х-белка и

АР(1-42)-пептида мозга флуоресцентным методом мы обнаружили, что эти фулле- рены способны поглощать свет в той же области, что и краситель ТТ, поэтому использование флуоресцентного анализа при оценке антиамилоидного эффекта для данных фуллеренов является невозможным (Бобылев, 2011). Для данных веществ электронная микроскопия использовалась как один из основных методов оценки их способности разрушать амилоидные фибриллы.

По данным флуоресцентного анализа натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена C₆₀ разрушала амилоидные фибриллы АР(1-42)-пептида и Х-белка (рис. 15Б, Д) (Бобылев и др., 2010б). Разрушение амилоидных фибрилл АР(1-42)-пептида и Х-белка этим производным приводило к значительному снижению интенсивности флуоресценции ТТ. АР(1-42)-пептид и Х-белок в присутствии C₆₀Cl(C₆H₄CH₂COONa)₅, добавленной до формирования ими амилоидных фибрилл, после 24 ч инкубации не увеличивали интенсивность флуоресценции тиофлавина Т Это также свидетельствует о способности C₆₀Cl(C₆H₄CH₂COONa)₅ предотвращать образование амилоидных фибрилл. Аналогичные данные были получены для NaFL, C₆₀-NO₂-пролин-NO₂ и С₆₀-аланина (рис. 15А, Г и 15В, Е) (Бобылев, 2011).

Таким образом, результаты, полученные с помощью флуоресцентного анализа, подтвердили электронно-микроскопические данные. ЭМ в комплексе с флуоресцентным анализом повышают объективность отбора наиболее эффективных антиамилоидных веществ.

Мы показали, что фуллерен C₆₀ и его водорастворимые производные разрушают амилоидные фибриллы мышечного Х-белка. Нам необходимо было проверить, как исследованные вещества действуют на другие фибриллярные структуры мышц. Так как фибриллы актина являются одним из структурных элементов сарко- мера сократительного аппарата мышц, мы исследовали способность фуллерена C₆₀ и его производных влиять на формирование фибрилл актина и взаимодействовать с ними in vitro.

Мышечный актин занимает второе место по количеству в саркомере после миозина, составляя 22% от общего количества саркомерных белков. Кроме того, фибриллярный актин является одним из основных компонентов цитоскелета эукариотических клеток. Это обуславливает интерес изучения его взаимодействия с фуллереном C₆₀. Актин является глобулярным белком с преобладанием в его в структуре а-спирали. Он способен формировать длинные нити. В мышечном сар- комере их длина составляет ~1 мкм. Однако сформированные in vitro нити актина могут достигать нескольких микрометров.

C помощью ЭМ мы исследовали способность С₆₀/ПВП, NaFL, а также C₆₀Cl(C₆H₄CH₂COONa)₅ разрушать нити актина, сформированные in vitro, или препятствовать их формированию (Бобылев и др., 2012a).

При исследовании способности C₆₀/nBn (м.м. ПВП 10000 и 25000) и NaFL влиять на структуру нитей актина показано, что данные вещества не разрушали нити актина в течение 24 ч (рис. 16Б) (для NaFL данные не представлены). Показано также, что глобулярный актин в присутствии C^/ПВП и NaFL способен строить нити (рис. 16В). Эти результаты свидетельствуют о специфическом взаимодействии данных фуллеренов с амилоидными фибриллами Х-белка и АР(1-42)-

пептида с последующим их разрушением, а не с фибриллами актина. Напротив, C₆₀Cl(C₆H₄CH₂COONa)₅ разрушала нити актина, а также препятствовала их формированию (рис 16Г, Д).

Анализируя полученные ЭМ данные о влиянии исследованных производных фуллерена С₆₀ на филаментообразование актина, можно заключить, что гидрофобные взаимодействия вносят основной вклад в способность фуллерена С₆₀ связываться с патологическими для клетки амилоидными фибриллами и разрушать их, не нарушая структуры фибрилл актина. Однако результаты, полученные для С₆₀Q(C₆H₄CH₂COONa)₅, которая препятствовала формированию нитей актина и разрушала их, вызывают сомнения по поводу возможности ее применения на биологических объектах. Поэтому мы провели исследования токсичности использованных производных фуллерена С₆₀ и его комплексов (Bobylev et al., 2011; Бобылев и др., 2012b).

В качестве объекта исследования токсического действия фуллерена С₆₀ и его производных была выбрана культура клеток карциномы гортани человека HEp-2. Эта клеточная культура широко используется в качестве модели, так как она не требует сложных сред, обладает четким митотическим индексом и на вторые-третьи сутки образует монослой.

Мы показали, что С₆₀/ПВП (м.м. ПВП 25000 и 10000) не оказывали токсического действия на культуру клеток НЕр-2 (рис. 17А). В этой культуре клеток наблюдалась их 100-процентная выживаемость при добавлении как комплексов С₆₀ с поливинилпирролидоном, так и самого полимера ПВП с молекулярными массами 25000 и 10000 в диапазоне концентраций 0,016-2 мг/мл.

Исследование цитотоксичности NaFL, С₆₀-аланина и С₆₀-К0₂-пролина показало ее отсутствие на HEp-2 культуру клеток в диапозоне концентраций 0,016-2мг/мл для С₆₀-аланина (рис. 17В) и NaFL, а также 0,001-0,2 мг/мл для С₆₀-К0₂-пролина (рис. 17Б).

C₆₀Cl(C₆H₄CH₂COONa)₅ оказывала выраженное токсическое действие на исследуемую культуру клеток в диапазоне концентраций 0,016-2 мг/мл (рис. 17Г), что наряду с данными по разрушающему действию на мышечный актин исключает ее из списка потенциальных антиамилоидных веществ.

Нам не удалось исследовать токсичность C^-fNO^-пролина и C₆₀-NO₂-пролин- NO₂ на клеточной культуре. Это связано с их способностью образовывать крупные (до 200 нм и более) нерастворимые агрегаты (данные электронной микроскопии).

Анализируя имеющиеся экспериментальные данные, мы выделили наиболее эффективные и нетоксичные антиамилоидные вещества среди исследованных производных фуллерена C₆₀. В таблице представлены основные свойства, на наш взгляд, определяющие эффективность изучаемых веществ. Среди них основными являются антиамилоидный эффект, оказываемый фуллереном или его производными на амилоиды Х-белка и АР(1-42)-пептида, а также токсические свойства фуллеренов.

Из таблицы следует, что фуллеренолат натрия является наиболее эффективным и нетоксичным антиамилоидным веществом. Он не образует агрегатов, способен разрушать амилоиды и предотвращать их образование, нетоксичен, и его антиамилоидный эффект можно регистрировать по интенсивности флуоресценции ТТ

Рис. 16. Электронные микрофотографии актина в присутствии и отсутствие С₆₀/ПВП и

^C60^Cl(^C6^H4^CH2^COONa)5

А - нити актина в 0,1М растворе КСІ, pH 7,0. Б - нити актина в присутствии С₆₀/ПВП, добавленного до формирования нитей. В - актин в присутствии С₆₀/ПВП, добавленного после формирования нитей. Весовое соотношение актина и С₆₀/ПВП 1:1. Актин в присутствии C₆₀Cl(C₆H₄CH₂COONa)₅, добавленной до (Г) и после (Д) образования филаментов. Весовое соотношение актина и C₆₀Cl(C₆H₄CH₂COONa)₅ 1:1. Инкубация 24 ч. Негативное окрашивание 2-процентным водным раствором уранил- ацетата. Шкала 100 нм

Рис. 17. Исследование цитотоксического действия исследованных фуллеренов А - комплексы фуллерена С₆₀ с поливинилпирролидоном (1 - С₆₀/ПВП₁₀₀₀₀; 2 - С₆₀/ПВП₂₅₀₀₀). Б - С₆₀-ИО₂-пролин. В - Сб0-аланин. Г - натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена Сб0

Также в группу наиболее эффективных и нетоксичных антиамилоидных веществ можно отнести комплексы фуллерена C₆₀ с ПВП, поскольку наряду с сильными антиамилоидными свойствами, низкой агрегационной способностью, у этих комплексов отсутствует токсичность. Мы также показали, что С₆₀/ПВП (м.м. ПВП 10000 и 25000) и фуллеренолат натрия не препятствуют филаментообразованию актина и не разрушают его нити in vitro.

Среди всех исследованных производных фуллерена C₆₀ были отобраны фуллеренолат натрия и комплексы фуллерена C₆₀ с ПВП как наиболее эффективные и нетоксичные антиамилоидные вещества, на основе которых могут быть созданы антиамилоидные препараты.

Таким образом, наши комплексные методические подходы, с одной стороны, дающие оценку антиамилоидных свойств разных препаратов как визуальным так и спектральным методами, а с другой - оценку цитотоксичности исследуемых антиамилоидных веществ, позволяют осуществлять подбор наиболее ценных и не-

Сравнительная оценка эффективности антиамилоидных веществ

¹ Есть данные том, что введение в мозг крысам фуллерена C₆₀ HyFn положительно влияет на когнитивные процессы в норме (Podolsky et al., 2007). Это косвенное указание на отсутствие у него токсичности.

токсичных лекарственных средств для борьбы с разными амилоидами и амило- идозами. Эти подходы могут быть отработаны на системах саркомерных белков семейства тайтина, благодаря их свойствам, благоприятствующим проведению эффективных исследований.

Литература

Барсуков А., Шустов С., Шкодкин И. и др. Гипертрофическая кардиомиопатия и амилоидоз сердца // Врач. 2005. Вып. 10. С. 42-46.

Бобылёв А.Г. Сравнительное изучение амилоидных свойств мышечных белков и АР(1-42)-пептида мозга. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Пущино, 2011.24 с.

Бобылёв А.Г., Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Подлубная З.А. Амилоиды мышечного Х-белка семейства тайтина и Ар-пептидов мозга: тестирование эффективности антиамилоидных препаратов // Технологии живых систем. 2009. Т 6. № 7. С. 46-53.

Бобылёв А.Г., Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д. и др. Действие нитропроизводных фуллерена C₆₀ на фибриллы АР(1-42)-пептида мозга и мышечного Х-белка // Биофизика. 2010a. Т 55. Вып. 3. С. 394-399.

Бобылёв А.Г., Марсагишвили Л.Г., Подлубная З.А. Флуоресцентный анализ действия водорастворимых производных фуллерена C₆₀ на амилоидные фибриллы Ар (1-42)-пептида мозга // Биофизика. 2010б. Т 55. Вып. 5. С. 780-784.

Бобылёв А.Г., Шпагина М.Д., Бобылёва Л.Г. и др. Антиамилоидные свойства производных фуллерена С₆₀ // Биофизика. 2012a. Т 57. Вып. 3. С. 416-421.

Бобылёв А.Г., Окунева А.Д., Бобылёва Л.Г. и др. Изучение цитотоксичности производных фуллерена С₆₀ // Биофизика. 2012б. Т 57. Вып. 5. С. 746-750.

Бобылёва Л.Г., Бобылёв А.Г., Шпагина М.Д. и др. Изучение амилоидных свойств гладкомышечного белка смитина // Технологии живых систем. 2010. Т. 7. № 8. С. 64-68.

Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. Структура и функции тайтина - гигантского белка скелетных и сердечных мышц: доказательства и предположения // Биофизика. 2007. Т 52. Вып. 6. С. 1030-1040.

Макарова Е.Г., Кордонец О.Л., Муганцева Е.А. и др. Влияние С₆₀ фуллерена на экспериментальных моделях болезни Альцгеймера in vitro и in vivo // Тез. докл. 3-его Международного Междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Украина. 2007. С. 149-150.

Марсагишвили Л.Г. Изучение амилоидных свойств саркомерных белков семейства тайтина: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Пущино, 2007. 24 с.

Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Емельяненко В.И., Подлубная З.А. Саркомерные белки семейства тайтина образуют амилоиды // Биофизика. 2005. Т 50. Вып. 5. С. 803-809.

Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Подлубная З.А. Временная зависимость образования амилоидных фибрилл Х-белка // Медико-биологические аспекты действия физических факторов. Ред. В.С. Улащик. Минск, Беларусь: Бизнесофсет, 2006. С. 242-245.

Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Подлубная З.А. Влияние фуллерена на формирование амилоидных фибрилл Х-белком // Тез. докл. ХХ Съезда Физиологического общества им И.П. Павлова. М., 2007. С. 326.

Марсагишвили Л.Г., Бобылев А.Г., Шпагина М.Д., и др. Влияние фуллеренов на амилоиды Х-белка // Биофизика. 2009. Т. 54. Вып. 2. С. 202-205.

Пиотровский Л.Б. Фуллерены в биологии и медицине: проблемы и перспективы // Фундаментальные направления молекулярной медицины. СПб.: Росток, 2005. С 195-268.

Пиотровский Л.Б., Киселев О.И. Фуллерены в биологии. СПб.: Росток, 2006. 336 с.

Подлубная З.А., Марсагишвили Л.Г. Роль мышечных цитоскелетных белков в патогенезе амилоидо- зов, в их диагностике и терапии // Вестник новых медицинских технологий. 2007. Т. XIV. № 4. С. 103-105.

Подлубная З.А., Марсагишвили Л.Г. Новые амилоидные белки семейства тайтина и их свойства: перспективы для диагностики амилоидозов // Технологии живых систем. 2008. Т. 5. № 5-6. С 11-21.

Подлубная З.А., Подольский И.Я., Шпагина М.Д., Марсагишвили Л.Г. Электронно-микроскопическое изучение влияния фуллерена на формирование амилоидных фибрилл AP(25-35) пептидом // Биофизика. 2006. Т 51. № 5. С. 795-798.

Сидоров Л.Н., Болталина О.В. Эндоэдральные и экзоэдральные фторпроизводные фуллеренов // Успехи химии. 2002. Т 71. С. 611-640.

Сторожаков Г.И., Гендлин Г.Е. Амилоидоз сердца // Сердечная недостаточность. 2000. Т 1. № 1. С. 30-34.

Akaishi T., Morimoto T., Shibao M. et al. Structural requirements for the flavonoid fiserin in inhibiting fibril formation of amyloid beta protein // Neurosci. Lett. 2008. Vol. 444. P. 280-285.

Alekseeva Y.A., Emel’yanenko V.I., Petropavlov N.N. Shpagina M.D., Podlubnaya Z.A. Searching for pro- teins-precursors of amyloids among titin family proteins // Abstr. Intern. Symp. «Biological motility», Pushchino, Russia, 2004. P. 208-209.

Andrievsky G. V., Bruskov V.I., Tykhomyrov A.A., Gudkov S. V. Peculiarities of the antioxidant and radioprotective effects of hydrated C60 fullerene nanostrutures in vitro and in vivo // Free Radic. Biol. Med. 2009. Vol. 47. № 6. P. 786-793.

BeckM, Mandy G. Solubility of C₆₀ // Full. Sci. Technol. 1997. Vol. 5. P. 291-310.

Bobylev A.G., Kornev A.B., Bobyleva L.G. et al. Fullerenolates: Metallated Polyhydroxylated Fullerenes with Potent Antiamyloid Activity // Organic & Biomolecular Chemistry. 2011. Vol. 9. P. 5714-5719.

Byeon S.R., Lee J.H., Sohn J.H. et al. Bis-styrylpyridine and bis-styrylbenzene derivatives as inhibitors for Abeta fibril formation // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007. Vol. 17. P. 1466-1470.

Byun J.H., Kim H., Kim Y. et al. Aminostyrylbenzofuran derivatives as potent inhibitors for Abeta fibril formation // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008. Vol. 18. P. 5591-5593.

ChiangL.Y., Lu F.-J., Lin J.-T. Free radical scavenging activity of water-soluble fullerenols // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1995. Vol. 12. P. 1283-1284.

Chiti F., Webster P., Taddei N. et al. Designing conditions for in vitro formation of protofilaments and fibrils // PNAS. 1999. Vol. 96. P. 3590-3594.

Conway K.A., Rochet J.C., BieganskiR.M., LansburyP.T. Kinetic stabilization of the alpha-synuclein protofibril by a dopamine-alpha-synuclein adduct // Science. 2001. Vol. 294. P. 1346-1349.

Dugan L.L., Gabrielsen J.K., Yu S.P. et al. Buckminsterfullerenol free radical scavengers reduce excitotoxic and apoptotic death of cultured cortical neurons // Neurobiology of Disease. 1996. Vol. 3. P. 129-135.

Forloni G., Colombo L., Girola L. et al. Antiamyloidogenic activity of tetracyclines: studies in vitro // FEBS Lett. 2001. Vol. 487. P. 404-407.

Goldsbury C.S., Wirtz S., Muller S.A. et al. Studies on the in vitro assembly ofAP(1-40): implications for the search for Ap fibril formation inhibitors // J. Struct. Biol. 2000. Vol. 130. P. 217-231.

Gruden M.A., Davudova T.B., Malisauskas M. et al. Autoimmune responses to amyloid structures of AP(25- 35) peptide and human lysozyme in the serum of patients with progressive Alzheimer’s disease // Dement. Geriatr. Cong. Disord. 2004. Vol. 18. P. 165-171.

Kim K., Keller T.C. III Smitin, a novel smooth muscle titin-like protein, interacts with myosin filaments in vivo and in vitro // J. Cell Biol. 2002. Vol. 156. P. 101-111.

Kim J.E., Lee M. Fullerene inhibit P-amyloid peptide aggregation // BBRC. 2003. Vol. 303 P. 576-579.

Kim Y., Randolph T. W., Stevens FJ., Carpenter J.F. Kinetics and energetics of assembly, nucleation, and growth of aggregates and fibrils for an amyloidogenic protein // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 2724027246.

Kim H., ParkB.S., Lee K.G et al. Effects of naturally occurring compounds on fibril formation and oxidative stress of beta-amyloid // J. Agric. Food Chem. 2005. Vol. 53. P. 8537-8541.

Klunk W.E., Pettegrew J.W., Abraham D.J. Quantitative evaluation of Congo red binding to amyloid-like proteins with beta-pleated sheet conformation // J. Histochem. Cytochem. 1989. Vol. 37. P. 1273-1281.

Krebs M.R., Bromley E.H., Donald A.M. The binding of thioflavine-T to amyloid fibrils lokalisation and implications // J. Struct. Biol. 2005. Vol. 149. P. 30-37.

LeVine IIIH. Thioflavine T interactions with amyloid P-sheet structures // Amyloid. 1995. Vol. 2. P. 1-6.

Marsagishvili L.G., Podlubnaya Z.A. Amyloidogenic properties of X-, C- and H-proteins of sarcomeric cy- toskeleton // J. Muscle Res. & Cell Motil. 2005. Vol. 26. № 1. P. 78-79.

McEwen C.N., McKay R.G., Larsen B.S. C-60 as a radical sponge // J. Am. Chem. Soc. 1992. Vol. 114. P. 4412-44.

ONuallain B., Williams A.D., Westermark P., Wetzel R. Seeding specificity in amyloid growth induced by heterologous fibrils // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P 17490-17499.

Podlubnaya Z.A., Shpagina M.D., Marsagishvili L.G. et al. Inhibitory effect of fullerene on AP(25-35) peptide fibrillization: electron microscopic study // Abstr. Intern. Symp. «Biological motility: basic research and practice». Pushchino, Russia, 2006. P. 155-156.

Podlubnaya Z.A., Podolski I. Ya., Marsagishvili L.G., ShpaginaMD. Effects of hydrated forms of C₆₀ fullerene on amyloids of X-protein and AP-peptides // Book of 8-th Biennial International Workshop «Fuller- enes and atomic clusters». St. Petersburg, Russia, 2007. P. 222.

Podolsky I.YA., Podlubnaya Z.A., Kosenko E.A. et al. Effects of Hydrated Forms of C₆₀ Fullerene on Amyloid beta-peptide Fibrillization in vitro and Performance of the Cognitive Task // J. Nanosci. Nanotech. 2007. Vol. 7. № 4/5. P 1479-1485.

Reinke A.A., Gestwicki J.E. Structure-activity relationships of amyloid beta-aggregation inhibitors based on curcumin: influence of linker length and flexibility // Chem. Biol. Drug. Des. 2007. Vol. 70. P 206-215.

Ruoff R.S., Tse D.S., MalhotraM., Lorents D.C. Solubility of fullerene C₆₀ in a variety of solvents // J. Phys. Chem. 1993. Vol. 97. P 3379-3383.

Sivaraman N., Dhamodaran R., Kaliappan I. et. al. Solubility of C₆₀ in organic solvents // J. Org. Chem. 1992. Vol. 57. P 6077-6079.

Uversky VN., Fink A.L. Conformational constraints for amyloid fibrillation: the importance of being unfolded // Biochim. Biophys. Acta. 2001. Vol. 1698. P 131-153.