КАНЦЕРОГЕНЕЗ КАК КОМПЛЕКСНОЕ ИЗМЕНЕНИЕ ГЕНОТИПА КЛЕТКИ

Канцеризация (канцерогенез, озлокачествление, малигнизация) - ряд изменений генотипа и фенотипа клетки, которые окончательно придают ей свойства злокачественной (малигнизированной).

ческих изменений, которые через трансляцию изменяют клеточный фено­тип. Известно, что изменения генетического материала в виде амплифика­ции генов, транслокации хромосом и утраты хромосомами своих частей (де- леции), которые in vitro часто вызывают озлокачествление клетки, in vivo не всегда приводят к малигнизации.

В настоящее время общепринятая схема механизма канцеризации вклю­чает ряд вполне определенных этапов. Инициирующим моментом канцери­зации признают действие на клетку ряда генотоксических канцерогенов (хи­мические соединения, токсины, ионизирующее излучение и др.), которые придают геному клетки свойство определять предрасположенность к пато­генной реакции малигнизации на действие внешних и внутренних факто­ров или сразу вызывают озлокачествление клетки. Канцерогенез начинают нарушения генетического материала клетки (альтерации генома) в виде ак­тивации прото-онкогенов (доминирующие альтерации) и (или) инактива­ция генов белков супрессоров опухолевого роста, эффект которых на эксп­рессию генома клетки противодействует канцерогенезу (гены-супрессоры клеточного роста). Изменение генома клетки, обуславливающее канцеро­генез, составляют сниженная экспрессия генов белков, подавляющих кле­точную пролиферацию и злокачественный клеточный рост (гены-супрессо­ры опухолей), и усиленная экспрессия генов, продукты которых, воздействуя на геном, усиливают клеточную пролиферацию (прото-онкогены).

Канцерогенез клетки - это во многом многоступенчатый процесс на­копления изменений генома как причины изменения фенотипа клетки экви­валентного окончательной малигнизации.

Результаты экспериментов, в основном проведенных во второй полови­не XX века, позволили предположить, что изменения фенотипа клетки, ха­рактеризующие ее озлокачествление, представляют собой прямое следствие изменений или повреждений клеточного генома (генетическая теория кан­церогенеза). Альтернативой генетической теории канцерогенеза выступает эпигенетическая теория злокачественной трансформации клетки. Эпиге­нетическая теория связывает канцерогенез с нарушениями регуляции кле­точного роста, функций клетки и экспрессии генов, составляющих ее ге­ном, без изменений и повреждений самого генетического материала.

Свидетельством в пользу генетической теории рака является выявление у веществ и воздействий на клетку (ионизирующие излучения и др.), кото­рые способны повреждать ДНК и менять ее структуру (мутагены), свойств канцерогенов. Установлено, что предшественники злокачественных клеток на пути озлокачествления претерпевают ряд повреждений и изменений ге­нетического материала, приводящих к образованию мутантных генов. Экс­прессия мутантных генов дает фенотип клетки, определяющий ее озлока­чествление. Эти генетические изменения происходят в клетках органов, где первично возникают злокачественные опухоли и получили название сома­тических мутаций. Тем самым подчеркивается их отличие от мутаций ге­нетического материала в гаметах, которые передаются по наследству.

В начале шестидесятых годов экспериментальным путем было показа­но, что включение генов ДНК-содержащих и других вирусов (вирусных он­когенов) в состав генома инфицированной клетки приводило к изменениям клеточного фенотипа эквивалентным клеточной малигнизации. Длительное присутствие вирусных онкогенов в составе генома злокачественной клетки было необходимым условием сохранения ее злокачественности. После вы­ведения вирусных онкогенов из генетического материала клетки малигни- зация нередко подвергалась обратному развитию.

Вирусные онкогены, которые содержал геном клеток, малигнизирован- ных ретровирусами, были относительно небольшими по размерам и про­стыми по строению. Это позволило предположительно считать, что мута­ция небольшого числа генов из состава генома клетки может обусловить множество изменений ее фенотипа, приводящих к озлокачествлению. В шестидестях-семидесятых годах было впервые высказано предположение, что изменения генетического материала в небольшом числе генов как при­чина канцерогенеза в первую очередь нарушают реакцию клетки на сис­темные и местные интегрирующие регуляторные воздействия, в том чис­ле и в виде эффектов факторов клеточного роста. Гены, мутации которых могут быть одним из этапов озлокачествления, назвали онкогенами. Иден­тификация онкогенов связана с изучением трансформирующих ретровиру­сов (ТРВ). ТРВ - это РНК-содержащие вирусы, которые интегрируются в геном инфицированной клетки и включают ее генетический материал в свой собственный геном. Иногда это приводит к мутациям генов инфицирован­ной клетки, которые вирус включает в свой геном. Результатом такой мута­ции может быть образование онкогена, то есть гена, экспрессия которого служит одной из причин озлокачествления клетки.

Разработка технологии клонирования генов в начале восьмидесятых годов позволила выявить онкогены, играющие роль при озлокачествлении клеток разной локализации. Один из наиболее хорошо изученных онкогенов ШЛГ24 играет роль в озлокачествлении клеток мочевого пузыря (карцинома мочево­го пузыря человека). Это относительно небольшой по размерам онкоген вклю­чает только 6000 пар спаренных оснований ДНК, тогда когда геном клетки содержит 6 миллиардов таких пар. Тем не менее, онкоген качественно меняет фенотип клетки, вызывая изменения ее размера, секреции клеткой факторов роста, нарушение связей клетки с близлежащими клетками, а также ряд дру­гих изменений фенотипа, включающих приобретение способности образо­вывать злокачественную опухоль и метастазировать.

Онкоген карциномы мочевого пузыря, выявленный с помощью исполь­зования технологии клонирования генов, происходил из нормального кле­точного гена, строение которого была почти идентично структуре Е.1/Т24.

Прото-онкогены содержит геном многих клеток многих организмов. Это позволяет считать их играющими важную роль в функционировании клеток и всего организма. Поэтому прото-онкогены остались незатронуты­ми мутациями в течение всего длительного пути эволюции. Вовлечение прото-онкогенов в канцерогенез после их трансформации в онкогены про­исходит только в результате относительно редких повреждений генетичес­кого материала клетки. В результате этих повреждений нарушаются функ­ции прото-онкогенов, что расстраивает систему регуляции клеточного роста.

Для многих прото-онкогенов, мутация которых в составе генома транс­формирующего ретровируса была причиной малигнизации клеток инфици­рованной клеточной культуры, была установлена способность превращать­ся in vivo в онкогены в результате мутаций, не связанных с действием вирусов. Так Ha-ras-онкоген (англ. rat’s sarcoma-саркома крыс), превраще­ние которого в онкоген из протоонкогена было связано с эффектом на геном клеток ретровируса саркомы крыс, по строению своему был почти иденти­чен EJ/T24. Оказалось, что прото-онкоген аЫ (англ. mouse Abelson leukemia - лейкемия мышей Абельсона), впервые идентифицированный как протоон­коген при исследовании культуры клеток, инфицированной ретровирусом, вызывающим у мышей лейкемию, участвовал в канцерогенезе при миело- генных лейкемиях у людей, не инфицированных ретровирусом. Прото-он­коген туе (англ. avian myelocytomatosis - миеломатоз птиц), который транс­формировался в онкоген после включения в геном соответствующего ретровируса, был причастен к этиологии многих хронических лейкемий, возникавших без инфицирования больных ретровирусами (табл. 14.1). Транс­формацию прото-онкогенов в онкогены обуславливают различные сомати­ческие мутации. Мутация, вызывающая рак мочевого пузыря, - это точеч­ная мутация (генная или точечная мутация - это результат изменения нуклеотидной последовательности молекулы ДНК в определенном участке хромосомы, гене), которая касается только одной пары спаренных основа­ний двойной спирали ДНК.

Озлокачествление клетки начинается с изменения структуры ДНК под влиянием способной вызывать изменения нуклеотидной последовательно­сти ДНК формы канцерогена (реактивной формы канцерогена) или свобод­ных кислородных радикалов при их усиленном образовании в клетке. Из­менение структуры ДНК служит причиной мутации определенных генов (прото-онкогенов) и генов-супрессоров опухолей. Экспрессия измененного генома клетки, содержащего онкогены и инактивированные гены-супрессо- ры опухолей, патологически меняет клеточный фенотип. В результате клет­ка приобретает свойства, характеризующие ее как злокачественную.

Когда у определенного химического вещества выявляют свойство всту­пать в реакцию с ДНК, меняя ее структуру и вызывая мутации генов как причину озлокачествления различных клеток, то его относят к ДНК-реак- тивным или генотоксическим канцерогенам. Большинство из канцероге­нов, чье действие вызывает малигнизацию клеток организма человека, - это генотоксические канцерогены.

Действие некоторых из гормонов (диэтилстильбэстрол, эстрадиол и др.) ведет к образованию в организме веществ со свойствами генотоксических канцерогенов.

При обмене веществ в нормальной клетке высвобождаются свободные кислородные радикалы.

Вещества способные вступать в реакции метилирования и этилирова- ния с ДНК также могут быть ДНК-реактивными канцерогенами. Под мети­лированием в молекулярной биологии понимают присоединение метило­вой группы к цитозиновому остатку как элементу двойной спирали дезоксирибонуклеиновой кислоты. В результате метилирования гены, со­

ставляющие двойную спираль ДНК, становятся неактивными. Метилиро­вание может быть нормальным процессом регуляции экспрессии элемен­тов генома. В частности, метилирование служит механизмом клеточной диф­ференциации В-лимфоцитов. Метилирование может закрепляться в генетическом материале гамет и определять фенотипические признаки, пе­редаваемые по наследству при мейозе (импринтинг, англ. imprinting-штам­пование, закрепление информации). Нередко метилирование подвергается обратному развитию (деметилирование), что меняет экспрессию генома и функции клетки, в некоторых случаях приводя их в соответствие с биологи­ческой целесообразностью.

Если действие генотоксического канцерогена приводит к метилирова­нию гена-супрессора опухоли, которое инактивирует этот ген, то такое из­менение генома клетки и связанная с ним модификация фенотипа может служить одним из этапов канцерогенеза.

Канцерогены, способные вызывать метилирование или этилирование ДНК ведут к появлению в ее составе 0⁶-ал кил гуанинов. В клетках суще­ствует система восстановления структуры ДНК, измененной через метили­рование или этилирование. В результате ее действия, связанного с активно­стью фермента метилтрансферазы, каждый моль 0⁶ метиловой группы трансформируется в один моль сульфгидрильного остатка. Исследование данной эндогенной системы восстановления структуры ДНК привело к иден­тификации многих канцерогенов.

Чаще всего одним из этапов канцерогенеза при возникновении разных злокачественных опухолей человека является инактивация гена-супрессора опухолей, экспрессия которого дает фосфопротеин р53. Ген р53 локализо­ван на коротком плече семнадцатой хромосомы. Функция данного фосфоп- ротеина состоит в торможении клеточного роста и блокаде злокачествен­ной трансформации клетки. Продукт гена р53 блокирует малигнизацию, задерживая пролиферацию клетки с измененной нормальной нуклеотидной последовательностью ДНК, что дает системам восстановления нормальной структуры ДНК достаточное время для достижения своего конечного по­лезного присособительного результата. Для этого р53 активирует транскрип­цию генов, кодирующих белки, которые подавляют пролиферацию клетки. Инактивация гена р53 или предрасполагает к канцерогенезу через неогра­ниченную пролиферацию или служит одной из причин озлокачествления клетки в случае потери фосфопротеином вследствие мутации гена свойства блокировать канцерогенез. Синтез и содержание р53 снижены в клетках большинства злокачественных опухолей легких, при колоректальном раке (у 50 % больных) и раке мочевого пузыря. Инактивация гена р53 чаще всего представляет собой последний этап изменения генетического материала клетки на пути ее озлокачествления.

При канцерогенезе, ведущем к образованию многих злокачественных опухолей человека, сначала происходит делеция (потеря, удаление) одного из аллелей гена р53. Оставшийся аллель (альтернативная форма гена) пре­терпевает мутацию. Если делеции одного из аллелей нет, то для инактива­ции гена-супрессора клеточного роста необходимы мутации двух аллелей.

Обусловленная мутацией замена лишь одной аминокислоты в составе р53 может инактивировать его как протеин, подавляющий пролиферацию кле­ток и тем самым препятствующий малигнизации. Об инактивации соответ­ствующего гена-супрессора опухолей свидетельствует возросшая способ­ность р53 связываться с белком теплового шока Ьвр70. Мутации гена р53, играющие роль в канцерогенезе, неоднородны по механизму возникнове­ния. В частности инактивировать ген могут транзиция^[4] и изменение струк­туры одной пары спаренных азотистых оснований ДНК. Это указывает на полиэтиологичность мутации гена-супрессора опухолей р53 как одного из этапов канцерогенеза.

Если онкогенная мутация закрепляется в геноме всего организма и по­падает в генетический материал гамет, то потомство наследует высокую предрасположенность к политопным злокачественным опухолям, то есть одну или две инактивированные аллели прото-онкогена.

Синдром Ли-Фраумени - это наследуемое по аутосомально-доминант- ному типу состояние высокой предрасположенности к злокачественному клеточному росту различной локализации (опухоли надпочечников, мо­лочной железы, гортани, легких, мозга, лейкозы и лимфомы), при котором вероятность озлокачествления клеток велика на любом этапе онтогенеза. Фибробласты кожи больных с синдромом Ли-Фраумени высокорезистен­тны к ионизирующей радиации (характерная особенность клеток, всту­пивших на путь канцерогенеза) и содержат в 3-8 раз больше нормального продукта экспрессии прото-онкогена с-тус. Кроме того, в них активиро­ван прото-онкоген с-га/. Предрасположенность к канцерогенезу при синд­роме Ли-Фраумени представляет собой результат двух мутаций двух алле­лей гена р53. Один аллель мутирует в ряду предшествующих поколений предков больного, а второй - по ходу онтогенеза. Аналогично происходит и двухэтапное изменение генетического материала клеток, предраспола­гающее к возникновению ретинобластомы. Данный механизм наследова­ния и приобретения предрасположенности к раку и индукции канцероге­неза получил название «двух последовательных ударов по генетическому материалу клетки».

Прото-онкогены - это элементы генома клетки, которые кодируют бел­ки (прото-онкопротеины), необходимые для нормального функционирова­ния систем регуляции клеточного роста. Обычно эти гены кодируют белки, играющие важную роль в регуляции экспрессии генов или в передаче сиг­нала геному от цитокинов со свойствами факторов клеточного роста. Мута­ция прото-онкогенов ведет к их активации, то есть к приобретению продук­тами их экспрессии свойств онкопротеинов, белков, чье действие на клетку может привести к малигнизации клетки. В настоящее время известно более чем 50 прото-онкогенов (табл. 14.1).

Онкогены составляют разнородную группу «раковых генов», которые, возникая в результате мутаций прото-онкогенов, обладают способностью вызывать злокачественное перерождение клетки. Одна из частых причин мутаций прото-онкогенов - это нарушение нормального функционирова­ния фермента ДНК-полимеразы. Онкогены могут происходить из генома содержащих рибонуклеиновую кислоту вирусов или быть элементом гено­ма нормальной немалигнизированной клетки (прото-онкогены).

Кроме точечных мутаций, механизмом активации прото-онкогенов мо­гут быть цитогенетические аномалии: транслокация, амплификация генов, а также потеря хромосомами своих частей (делеция).

Транслокация - это перемещение сегмента одной хромосомы в другую. Филадельфийская хромосома - это небольшая акроцентрическая хромосо­ма, которая представляет собой остаток двадцать второй хромосомы после транслокации дистальной части ее длинного плеча в длинное плечо девя­той. Чаще всего транслокация приводит к образованию филадельфийской хромосомы в полипотентной стволовой клетке и сохраняется в клетках ми- елоидной, эритроидной, мегакариоцитарной и лимфоидных линий клеточ­ной дифференциации. Транслокацию с образованием филадельфийской хромосомы как причину возникновения онкогена и канцерогенеза выявля­ют у 95 % хронической миелоидной лейкемией и у 5-20 % пациентов с острой лимфоцитарной лейкемией. В результате транслокации ген c-abl из состава двадцать второй хромосомы становится в положение юкстапози- ции с геном Ьсг девятой, функция которого еще полностью не ясна. Это ведет к образованию нового гибридного гена, экспрессия которого завер­шается образованием онкопротеина P210*^cr/eW. Онкопротеины, представля­ющие собой продукт экспрессии онкогена, образовавшегося при возникно­вении из двух генов гена-гибрида (слияние генов) называют слившимися или спаянными белками (от англ. fusion proteins, что можно перевести как «бел­ки, образовавшиеся в результате слияния»).

Действие онкопротеинов, приводящее к малигнизации клетки, всегда можно свести к изменениям или индукции конкретных биохимических ре­акций. Так онкопротеин Р210^WaW предположительно обладает активностью тирозинкиназы, которая не зависит от функционирования эндогенной сис­темы регуляции активности данного энзима. Такой же активностью облада­ет прото-онкопротеин (продукт экспрессии онкогена src). Тирозинкиназа осуществляет фосфорилирование остатка тирозина в составе белковых мо­лекул. Тирозинкиназа фосфорилирует белки, находясь в составе тирозинки- назного рецептора наружной клеточной мембраны. Через фосфорилирова­ние осуществляется передача сигнала к интенсификации пролиферации клеток на уровне взаимодействия ФР со своими рецепторами на поверхности клеток (эпидермальный и тромбоцитарный факторы клеточного роста и др.).

Амплификация генов (лат. Amplificatio -распространение, увеличение) - это возникновение в ядре клетки одного или нескольких дубликатов целой хромосомы, ее частей или отдельных фрагментов генетического матери­ала. В ходе амплификации прото-онкогены становятся онкогенами как в результате мутаций и слияний генов, так и вследствие повышенного син­теза клеткой продуктов копий амплифицированных прото-онкогенов, сти­мулирующих клеточный рост. Морфологически амплификация генов про­являет себя появлением в ядре хроматиновых телец, не связанных с хромо­сомами, или изменением генетического материала, которое характеризует возникновение гомогенно окрашиваемых участков хромосом. Так, канце­рогенез при нейробластоме отчасти представляет собой результат ампли­фикации прото-онкогена N-туе.

Делеция, то есть потеря хромосомами части входящего в их состав генетического материала, служит причиной канцерогенеза, когда эта часть содержит ген-супрессор опухолей. Потеря одного плеча первой хро­мосомы служит одним из этапов многоступенчатого изменения генетичес­кого материала клетки, составляющего канцерогенез при образовании твер­дых злокачественных опухолей.

Высокая частота деления клеток предрасполагает к канцерогенезу, так как снижает время, «отпущенное» для воссстановления нормальной нукле­отидной последовательности ДНК. Растущий организм более предрасполо­жен к индукции малигнизации эффектом канцерогенов. Воздействие ради­ации при атомной бомбардировке Хиросимы привело к возникновению рака молочной железы по ходу онтогенеза в четыре раза чаще у тех женщин, которым в момент взрыва было 10-15 лет (период онтогенеза, в который наиболее интенсивна пролиферация клеток молочной железы).

ДНК-реактивные канцерогены вступают в прямые или опосредованные реакции не только с ДНК, но и с другими протеинами организма. Это ведет к появлению аномальных белков, специфических для того или иного варианта канцерогенеза (маркеры злокачественных клеточного роста и опухолей).

Одного изменения генетического материала, включающего все этапы канцерогенеза на уровне генома одной клетки, которое вызывают действие химических канцерогенов, свободных кислородных радикалов, онкогенных вирусов и эффект ионизирующих излучений, еще недостаточно для возник­новения из одной малигнизированной или ряда озлокачествленных клеток раковой опухоли.

Процесс возникновения выявляемых при обследовании больного клона (гр. klon — ветвь, побег, отпрыск) злокачественных клеток или раковых опу­холей из одной малигнизированной или группы озлокачествленных клеток называют промоцией (англ. promotion, содействие). Экзогенное вещество или эндогенный агент эндокринной, пара- или аутокринной регуляции, чье действие на клетки обуславливает промоцию, называют промотором. Про­мотор не может вызвать рак без предшествующего многоэтапного и ком­плексного изменения генетического материала клетки.

Воздействуя на малигнизированные клетки, промоторы ускоряют их клональную экспансию как причину возникновения злокачественных опу­холей. Многие из промоторов вызывают промоцию через увеличение ак­тивности фермента протеинкиназы С и снижение в клетке активности энзи­мов, относящихся к классу белковых фосфатаз. Во многом действие промоторов сводится к нарушению межклеточных соединений в области зазоров между клетками и функциональных связей между ними. Действие

Таблица 14.2

Классификация химических соединений со свойствами канцерогенов

Механизм действия

А. Генотоксические

1. Не требующие акти­вации

2. Становящиеся кан­церогенами после акти­вации (проканцерогены)

3. Неорганические кан­церогены, не требую­щие активации

Б. Эпигенетические

4. Твердые канцеро­гены

5. Гормоны

6. Иммунодепрессанты

7. Вещества, усиливаю­щие образование сво­бодных кислородных радикалов (СКР)

8. Цитотоксические вещества

9. Вещества, предрас­полагающие к геноток­сическому действию ДНК-реактивных канце­рогенов

Прямая реакция электрофильных органических соединений с ДНК Вступает в реакцию с ДНК после трансформации на путях метабо­лизма

Избирательные нарушения репли­кации ДНК и систем восстановле­ния ее нормальной структуры после мутации

Обычно оказывают действие на мезенхимальные клетки и ткани; механизм канцерогенного дей­ствия неизвестен Системная эндокринопатия как причина неконтролируемой кле­точной пролиферации Ускоряют выход малигнизирован­ных клеток из-под контроля сис­темы иммунитета Рост содержания в клетке свобод­ных кислородных радикалов, пре­обладающий над способностью клетки инактивировать и элимини­ровать СКР

Цитолиз как причина воспаления, усиления пролиферации и роста содержания СКР в клетке и интер- стиции

Усиление клеточной пролифера­ции, которое уменьшает время, необходимое для эффективной работы систем восстановления структуры ДНК

Бис(хлорметил) эф ир

Винилхлорид,

бензопирен

Никель,

хром

Полимеры, использу­емые для изготовления современных упаковоч­ных материалов, фольга Эстрадиол, диэтил стильбэстрол

Циклоспорин А, анти- лимфоцитарная сыво­ротка

Клофибрат,

диэтилгексилфгалат

Нитрилотриацетат,

четыреххлористый

углерод

Фенолы,

желчные кислоты

промотора как причина промоции должно быть достаточно интенсивным, непрерывным и длительным. В противном и крайне желательном случае злокачественная опухоль подвергается обратному развитию.

У мышей, инфицированных вирусом, вызывающим рак молочной желе­зы, действие эстрогенов ведет к возникновению раковых опухолей. При этом образование опухоли находится в прямой связи с дозой эстрогенов, а также частотой и длительностью их парентерального введения. Если мышей не инфицировать вирусом, то эстрогены, вводимые в той же дозе, таким же образом и столь же длительно, рака не вызывают. В данном случае эстроге­ны выступают в роли промоторов.

Промоторы могут обладать тканевой специфичностью. Так желчные кислоты - это промоторы рака толстой кишки, а сахарин натрия может обус­лавливать промоцию при раке мочевого пузыря.

Канцерогены - это химические вещества или воздействия на клетки как экзогенного, так и эндогенного происхождения, обуславливающие из­менения генетического материала клетки при канцерогенезе или промо­цию (табл. 14.2).

Генотоксические или ДНК-реактивные канцерогены - это мутагены, которые обладают свойством менять нуклеотидную последовательность ДНК, активируя прото-онкогены или инактивируя гены-супрессоры опухо­лей. Канцерогены, чье действие не затрагивает генетический материал клет­ки, и которые выступают исключительно в роли промоторов, называют эпи­генетическими канцерогенами. Эпигенетические канцерогены вызывают злокачественные новообразования и клоны малигнизированных клеток че­рез свои цитотоксические эффекты, хроническое травмирование тканей, при эндокринопатиях, приводя к иммунодефициту и другим системным сдви­гам во взаимосодействии функциональных систем, направленном на под­держание гомеостазиса.