<<
>>

Анализ пролиферативной активности клеток

3.1. Кривые роста

Для получения кривых роста клетки высевали в ячейки 24-камерных культуральных планшетов и культивировали в стандартной среде. В зависимости от задач конкретных экспериментов плотность посадки варьировала от 101 до 103 клеток/см2 (указано в пояснениях к соответствующим разделам в главе "Результаты").

Через определенный срок культивирования клетки отмывали раствором Эрла, снимали трипсином-ЭДТА и просчитывали их количество в аликвотах суспензий на гемоцитометре или автоматическом счетчике клеток.

В части экспериментов на прикрепленных к субстрату клетках использовали метод компьютеризированной видео-микроскопии (использовался микроскоп Diaphot-TMD, Nikon, оборудованный цифровой видеокамерой Mintron OS-75D; изображение передавалось на компьютер через видеокарту с отдельным входом). В этом случае просчет числа клеток проводили на распечатках нескольких случайно выбранных полей зрения микроскопа. Следует заметить, что данный способ является более удобным, поскольку ошибка при подсчете клеток значительно ниже (в среднем +2-5 %), чем при использовании для просчетов клеточной суспензии с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.

3.2. Оценка синтеза ДНК по включению меченого предшественника

Клеточные культуры, растущие в ячейках 24- или 48-ячеечных планшетов,

инкубировали в присутствии [3Н]-тимидина (0.1 мкКи/мл) в течение 18 часов. Затем, клетки переносили на лед и обрабатывали согласно Gimbrone et al. [1974]: трижды отмывали от невключившейся метки раствором Эрла, фиксировали смесью 96° этанол-уксусная кислота (3:1) в течение 15 минут, экстрагировали 10 % ТХУ (20 минут), споласкивали 5 % ТХУ и 96° этанолом, после чего лизировали 0.5 М раствором едкого натра. Полученные лизаты переносили в сцинтилляционные флаконы и присчитывали в толуольном сцинтилляторе (толуол - 70 %, абсолютный этанол - 30 %, РРО - 5 г/л, РОРОР - 0,1 г/л) на наличие бета-радиоактивности на счетчике Rack Beta (LKB). Для получения статистически значимых результатов каждую группу просчитывали не менее чем в трех повторах.

id

3.3. Авторадиография

Через 18 часов инкубации в присутствии 1 мкКи/мл (3Н]-тимидина клеточные культуры отмывали раствором Эрла и фиксировали 10 минут в 2.5 % растворе глутарового альдегида на 0.1 М натрий-фосфатном или натрий-какодилатном буфере pH 7.2-7.4. После серии отмывок буфером и дистиллированной водой культуры обезвоживали 96° этанолом и высушивали. Полученные препараты покрывали фотографической эмульсией для авторадиографии (Ilford, К2) и экспонировали в течение 5-7 суток при +4°С. Обработку автографов проводили в соответствии с прилагаемой инструкцией проявителем Kodak D19. После докрашивания ядер гематоксилином Майера просчитывали тимидиновый индекс (% клеток, содержащих меченые ядра). В зависимости от плотности культур анализировали от 100-200 до 1000 клеток в нескольких полях зрения микроскопа.

4.

<< | >>
Источник: РОМАНОВ Юрий Аскольдович. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНДОТЕЛИЯ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ АТЕРОСКЛЕРОЗЕ. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. Москва - 2003 г. 2003

Скачать оригинал источника

Еще по теме Анализ пролиферативной активности клеток:

  1. 2.1.4. Превышение рО2 в клетке сверх уровня нормальных вариаций
  2. 6.2. Мембранотоксическая активность неоплазмы как патогенетический фактор изменения клеток крови и опухолевого роста
  3. ВВЕДЕНИЕ
  4. Непрямой иммуногистохимический метод исследования
  5. Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
  6. Тема № 6. Белки - маркеры клеточного цикла
  7. ОГЛАВЛЕНИЕ
  8. ВВЕДЕНИЕ
  9. Анализ пролиферативной активности клеток
  10. Пролиферативная активность ЭК аорты человека в культуре
- Акушерство и гинекология - Анатомия - Андрология - Биология - Болезни уха, горла и носа - Валеология - Ветеринария - Внутренние болезни - Военно-полевая медицина - Восстановительная медицина - Гастроэнтерология и гепатология - Гематология - Геронтология, гериатрия - Гигиена и санэпидконтроль - Дерматология - Диетология - Здравоохранение - Иммунология и аллергология - Интенсивная терапия, анестезиология и реанимация - Инфекционные заболевания - Информационные технологии в медицине - История медицины - Кардиология - Клинические методы диагностики - Кожные и венерические болезни - Комплементарная медицина - Лучевая диагностика, лучевая терапия - Маммология - Медицина катастроф - Медицинская паразитология - Медицинская этика - Медицинские приборы - Медицинское право - Наследственные болезни - Неврология и нейрохирургия - Нефрология - Онкология - Организация системы здравоохранения - Оториноларингология - Офтальмология - Патофизиология - Педиатрия - Приборы медицинского назначения - Психиатрия - Психология - Пульмонология - Стоматология - Судебная медицина - Токсикология - Травматология - Фармакология и фармацевтика - Физиология - Фтизиатрия - Хирургия - Эмбриология и гистология - Эпидемиология -