<<
>>

4.2. Функциональная гетерогенность популяций эндотелия

В предыдущем разделе удалось показать, что мелкие одноядерные ЭК, начинающие преобладать в культурах из обеих зон независимо от степени атеросклеротического поражения, демонстрируют "правильную" (с точки зрения биологической целесообразности) активность.

Дія того, чтобы исключить возможные артефакты, связанные с относительно длительным культивированием

этих клеток (по отношению к исходной смешанной популяции ЭК), была проведена следующая серия экспериментов.

Еще в ходе предшествующих исследований ЭК аорты человека было отмечено, что клетки имеют неодинаковое количество и распределение актиновых филаментов в цитоплазме. Последующий, более детальный, анализ организации актиновых филаментов позволил выявить один интересный факт. Мелкие одноядерные ЭК, как правило, содержат только пучки периферических актиновых филаментов в области межклеточных контактов, тогда как более крупные (полиплоидные) клетки - значительное количество волокон напряжения в центральной части цитоплазмы (Рис. 34). Поскольку концы актиновых филаментов используются клеткой для прикрепления к субстрату и определяют, в конечном счете, прочность этого взаимодействия, можно предположить, что отмеченные субпопуляции ЭК различаются по этому параметру и, следовательно, могут быть разделены. Подтверждением данного предположения является следующее наблюдение. При трипсинизации морфологически гомогенной культуры ЭК пупочной вены человека клетки ошариваются и открепляются практически одновременно в узкий промежуток времени. Напротив, в гетерогенных культурах ЭК аорты этот процесс более длителен: в первую очередь ошариваются мелкие одноядерные клетки и лишь на протяжении нескольких последующих минут инкубации - все остальные. Поэтому, данный методический прием был нами использован с целью разделения клеточных популяций.

Конфлуэнтные культуры ЭК 2-го пассажа, выращенные на 100-мм чашках Петри, отмывали раствором Эрла и заливали разведенным 1:10 теплым раствором

Рисунок 34.

Организация актиновых филаментов в мелких и крупных

полиплоидных ЭК в культуре. Окрашивание РИТЦ-фаллоидином; х500.

трипсина-ЭДТА. Чаїнку переносили на предметный столик фазово-контрастного микроскопа и визуально контролировали ошаривание и открепление клеток от подложки. После того, как основная масса мелких клеток начала терять контакт с пластиком, раствор трипсина с открепившимися клетками собирали в отдельную пробирку, куда предварительно добавляли 2-3-кратный объем охлажденной среды культивирования для ингибирования активности фермента. Оставшиеся на пластике клетки быстро споласкивали раствором Эрла и вновь заливали трипсином-ЭДТА, на этот раз — неразведенным. После открепления всех оставшихся клеток с ними поступали так же, как и с первой порцией. Обе суспензии центрифугировали, а клетки ресуспендировали в среде культивирования и высевали в ячейки 12-ячеечных культуральных планшетов. Плотность посадки подбирали экспериментально для каждой популяции путем последовательных разведений. В работу брали ячейки, содержащие на следующий день конфлюэнтный монослой ЭК. В этих культурах заменяли среду культивирования и через 48 ч использовали для со-культивирования с интимальными ГМК. Техника со-культивирования и методика анализа пролиферативной активности ГМК были описаны в предыдущих разделах работы.

Рисунок 35.

Культуры ЭК (А - 1 и Б - 2 фракции), получаемые в результате селективной трипсинизации.

Импрегнация нитратом серебра, Х200.

Данный методический прием позволил установить, что активность клеток популяций 1 и 2 в отношении пролиферативной активности ГМК диаметрально противоположна Так, клетки популяции 1 во всех случаях значительно ингибировали включение [3Н)-тимидина в ГМК. Тимидиновый индекс (процент клеток, содержащих меченые ядра) ГМК составил в среднем 48+18 по сравнению с контрольными культурами. Клетки популяции 2, напротив, практически не влияли на пролиферативную активность ГМК (104+24%).

Таким образом, в данной части работы впервые удалось разделить гетерогенную популяцию эндотелия аорты на две морфологически и функционально

различимых фракции: популяции мелких одноядерных и гипертрофированных и/или полиплоидных клеток. Степень разведения исходного раствора (0.05% трипсина, 0.02% ЭДТА) колеблется от 1:5 до 1:20 для различных образцов и при необходимости легко подбирается экспериментально. При оптимальной концентрации фермента и времени обработки удается разделить более половины всех клеток: около 30% составляют популяцию мелких одноядерных ЭК (популяция 1, Рис. 35 А); примерно столько же клеток остается в популяции более крупных полиплоидных одно- и многоядерных (популяция 2, Рис. 35 Б). Оставшаяся часть клеток содержит смесь тех и других и теряется на стадии промежуточной промывки. Таким образом, с помощью нехитрого приема удается получить две обогащенные на 90-95% морфологически различные клеточные субпопуляции.

5.

<< | >>
Источник: РОМАНОВ Юрий Аскольдович. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНДОТЕЛИЯ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ АТЕРОСКЛЕРОЗЕ. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. Москва - 2003 г. 2003

Скачать оригинал источника

Еще по теме 4.2. Функциональная гетерогенность популяций эндотелия:

  1. 2.3.6. Пероксигеназные условия в опухолевых клетках
  2. 2.5. Пероксигеназные процессы и лейкозогенез
  3. 6.2. Мембранотоксическая активность неоплазмы как патогенетический фактор изменения клеток крови и опухолевого роста
  4. 6.4. Расстройство других видов обмена и регуляциив организме опухоленосителя
  5. 10.2.2. Краткая медицинская характеристика последствий облучения. Понятие об острой и хронической лучевой болезни
  6. ЛЕКАРСТВЕННАЯ ТЕРАПИЯ
  7. Реабилитация с помощью * интраокулярных линз
  8. Трансплантационный иммунитет при кератопластике после ожоговой травмы глаза
  9. ОТЕК. ВОДЯНКА
  10. ПРИСПОСОБЛЕНИЕ. КОМПЕНСАЦИЯ НАРУШЕНИЙ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ.
- Акушерство и гинекология - Анатомия - Андрология - Биология - Болезни уха, горла и носа - Валеология - Ветеринария - Внутренние болезни - Военно-полевая медицина - Восстановительная медицина - Гастроэнтерология и гепатология - Гематология - Геронтология, гериатрия - Гигиена и санэпидконтроль - Дерматология - Диетология - Здравоохранение - Иммунология и аллергология - Интенсивная терапия, анестезиология и реанимация - Инфекционные заболевания - Информационные технологии в медицине - История медицины - Кардиология - Клинические методы диагностики - Кожные и венерические болезни - Комплементарная медицина - Лучевая диагностика, лучевая терапия - Маммология - Медицина катастроф - Медицинская паразитология - Медицинская этика - Медицинские приборы - Медицинское право - Наследственные болезни - Неврология и нейрохирургия - Нефрология - Онкология - Организация системы здравоохранения - Оториноларингология - Офтальмология - Патофизиология - Педиатрия - Приборы медицинского назначения - Психиатрия - Психология - Пульмонология - Стоматология - Судебная медицина - Токсикология - Травматология - Фармакология и фармацевтика - Физиология - Фтизиатрия - Хирургия - Эмбриология и гистология - Эпидемиология -