Морфологические исследования

Морфологические исследования полученного материала проведены в соответствии с общепринятыми стандартами, включая соответствующую проводку, фиксацию материала, приготовление гистологических срезов с последующей окраской гематоксилин-эозином [67,68].

2.3. Характеристика использованных для иммуногистохимических исследований моноклональных антител (МАТ)

Все использованные в работе МА Г были готовы к употреблению, а те из них, которые выпускались фирмой-производителем в виде концентрированного раствора, разводились в дилюэнте до рабочих разведений. Все МАТ были адаптированы для работы на парафинизированных срезах.

I. МАТ к АГ клеток лимфоидного гистогенеза ( параметры клеточного иммунитета).

1. МАТ к CD3-AT (Novocastra Lab. Ltd., Великобритания). Клон PS1, класс и субкласс иммуноглобулинов - IgG2a. Антитела к є-цепи СЭЗ-пептидной молекулы, состоящей из пяти полипептидных молекул массой от 16 до 28 kD. СБЗ-комплекс четко ассоциирован в лимфоцитах с поверхностным Т- клеточным рецептором ( TCR-receptor). Все Т-лимфоциты несут этот рецептор, следовательно, позитивная реакция на этот АГ тестирует наличие совокупной Т-клеточной популяции. Считается, что указанный комплекс вовлекается в проведение АГ-специфичного сигнала после контакта Т- лимфоцита с антиген-презентирующими клетками. Эти МАТ взаимодействуют с Т-клетками тимуса, костного мозга, периферической лимфоидной ткани и крови. МАТ были готовы к употреблению ( N-серия антител ). Гистологический срез, перед нанесением МАТ обрабатывался в цитратном буфере при 195 С в течение 10 мин.

2. МАТ к CD4-AT (Novocastra Lab. Ltd., Великобритания). Клон 1F6, класс и субкласс иммуноглобулинов - IgGl. CD4 молекула является одноцепочечным трансмембранным гликопротеином с молекулярной массой 59 kD.

3. МА Г к CD8-AT (Dako Corporation, США). Клон С8/144В, класс и субкласс иммуноглобулинов - lgG2b. МАТ взаимодействуют с полипептидом масса 32 kD, эквивалентном^' молекуле CD8. Эта молекула экспрессируется на мембране субпопуляции Т-лимфоцитов - Т-цитотоксических/супрессорных клетках. МАТ взаимодействуют с Т-цитотоксическими клетками периферической лимфоидной ткани, селезенки и крови. МАТ были готовы к употреблению ( N-серия антител ). Гистологический срез предварительно обрабатывался в цитратном буфере при 195 С в течение 10 мин.

II. МАТ к АГ В-лимфоцитов и основным классам иммуноглобулинов (параметры гуморального иммунитета).

1. МАТ к CD20-AT (Dako Corporation, США). Клон L26, класс и субкласс иммуноглобулинов - IgG2a. МАТ данного вида взаимодействуют с двумя нековалентно связанными компонентами массой от 33kD до 30 kD, присутствующими на В-лимфоцитах как крови, так и лимфоидных тканей. Иммуногистохимическая реакция тестируется на цитоплазматической мембране. В работе использовались МАТ N-ссрии, готовые к употреблению. Предварительная обработка гистологического среза не требовалась.

2. МАТ к IgG человека (Dako Corporation, США). Клон А57Н. МАТ интенсивно взаимодействуют с IgG-содержащими плазматическими клетками и их предшественниками, включая В-лимфобласты. Основная масса фолликулярных дендритных клеток лимфоидного глоточного кольца и герминативных центров лимфоидных фолликулов являются позитивными на наличие поверхностного IgG. Антитела перед работой разводились в соотношении 1:25. Гистологический препарат предварительно обрабатывался ферментом проназой.

3. МАТ к IgA человека (Dako Corporation, США). Клон 6Е2С1. МАТ взаимодействуют с тяжелой цепью ( a-цепь) двух IgA-изотипов (IgAl и IgA2 ). Антитела взаимодействуют с плазматическими клетками и их предшественниками, включая В-лимфобласты. Около 10% мантийной зоны лимфоидных фолликулов является позитивными на IgA. Антитела разводились перед работой в соотношении 1:25, а гистологический срез предварительно обрабатывался ферментом проназой.

4. МАТ к IgM человека (Dako Corporation, США). Клон R1/69. МАТ взаимодействуют с тяжелой цепью человеческого IgM. Антитела взаимодействуют с В-лимфоцитами лимфоидных фолликулов глоточного лимфоидного кольца. Наиболее выражена реакция в первичных лимфоидных фолликулах. Во вторичных лимфоидных фолликулах поверхностный IgM на лимфоидных клетках контрастирует мантийную зону, образую грубую сетчатость этих зон на препарате. Антитела также разводились перед работой в соотношении 1:25, а гистологический срез обрабатывался ферментом проназой.

Ш. МАТ к Кі67-антигену (Novocastra Lab. Ltd., Великобритания ). Клон ММ1. Класс и субкласс - IgGl. МАТ этого класса взаимодействуют с цитоплазматичекими компонентами быстропролиферирующих клеток и реагируют с клетками на всех стадиях пролиферативного цикла - Gl, S, М G2. Этот «пролиферативный» антиген идентифицирован на модели опухолевого роста, где выявлена сильная корреляционная взаимосвязь между индексом этого АГ и степенью дифференцированности опухоли. В лимфоидной ткани МАТ взаимодействуют с быстропролиферирующими клетками лимфоидного ряда. МАТ были готовы к употреблению (N-серия), гистологический срез предварительно обрабатывался в цитратном буфере при t 95 С в течение 10 мин.

IV. МАТ к CD31-AT (Dako Corporation, США). Клон JO/70A. Класс и субкласс - IgGl. Антитела данной специфичности интенсивно взаимодействуют с формалин-резистентным CD31-антигеном на эндотелиальных клетках. Взаимодействие происходит с гликопротеином массой 100 kD на эндотелиоцитах и с аналогичным белком массой 130 kD на тромбоцитах.

V. МАТ к bcl-2 - онкопротеину (Dako Corporation, США). Клон 124. Класс, субкласс иммуноглобулинов - IgGl. Белок bcl-2 принадлежит к семейству протоонкогенных белков, обладающих способностью ингибировать процесс апоптоза. В лимфоидном глоточном кольце эти МАТ взаимодействуют с малыми В-лимфоцитами в мантийной зоне и со многими клеточными элементами Т-зависимых зон. В герминативных центрах лимфоидных фолликулов этот тип МАТ прокрашивает отдельные клеточные элементы. МАТ были готовы к употреблению ( N-серия ), а гистологический срез предварительно обрабатывался в цитратном буфере с высоким pH в течение 10 мин.

VI. МАТ к CD68-AT (Dako Corporation, США). Клон КР1. Класс, субкласс иммуноглобулинов - IgGl. CD68 представляет собой трансмембранный гликопротеин массой 110 kD, тесно ассоциированный с мембраной тканевых макрофаюв. Этот антиген играет значительную роль в эндоцитозе и лизосомальной деградации фагоцитируемого материала, тем самым, принимая участие в презентации антигенов. МАТ взаимодействует с другими клеточными представителями системы мононуклеарных фагоцитов, такими как клетки Купфера, клетки почечного нефрона, активированные эндотелиоциты, клетками островков Лангерганса поджелудочной железы, а также с гемопоэтическими предшественниками миелоидного ростка кроветворения. МАТ были готовы к употреблению (N-серия), а гистологические срезы предварительно обрабатывались ферментом проназой.

VII. МАТ к эпителиальному AT (Dako Corporation, США). Клон Вег- ЕР4. Класс, субкласс иммуноглобулинов - IgGl. МАТ взаимодействуют с пептидами массой от 34 до 39 kD, экспрессирующихся на мембране и в цитоплазме нормальных эпителиальных клеток. Применение этого вида МАТ требует предварительной ферментной обработки гистологического препарата. МАТ были готовы к употреблению (N-ссрия). В лимфоидном глоточном кольце взаимодействуют с криптальиым эпителием и с многорядным плоским эпителием.

VIII. МАТ к CD35-AT (Dako Corporation, США). Клон Ber-MAC-DRC. CD35 принадлежит к группе СЗЬ/С4Ь - рецепторам к компонентам системы комплемента с молекулярной массой 190-220 kD. Этот антиген экспрессируется на фолликулярных дендритных клетках в лимфоидном глоточном кольце, а также на гранулоцитах, эритроцитах и подоцитах почечных нефронов. МАТ взаимодействуют с дендритными клетками лимфоидных фолликулов. В работе использовалось рабочее разведение 1: 25. Перед использованием МАТ гистологический срез обрабатывался ферментом проназой.

2.4.