Определение популяционного и субпопуляцнонного состава лимфоцитов периферической крови.
Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови обследованных детей определяли в
иммунофлуоресцентном тесте с использованием моноклональных антител (МАТ) производства ООО «Сорбент», Москва, ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России.
В работе использовали следующие МАТ. К маркеру общей популяции Т-лимфоцитов - CD3, к маркеру Т-хелперов - CD4, к маркеру Т- цитотоксических лимфоцитов - CD8, к маркеру В-лимфоцитов - CD20.
Лимфоциты из гепаринизированной крови выделяли центрифугированием на градиенте фиколл-верографина. К 1-0,1 млн. лимфоцитов в объеме 50 мкл. в лунки круглодонных микропланшет вносили 5 мкл МАТ к соответствующему клеточному маркеру и инкубировали 30-45 мин. при +4°С. После отмывания, к осадку клеток добавляли 50 мкл. F(ab)2- фрагментов овечьих антител к иммуноглобулинам мыши, меченных ФИТЦ и разведенных 1: 100. Клетки суспендировали и инкубировали 30 мин. при +4°С. После отмывания окрашенные клетки на предметном стекле просматривали в люминесцентном микроскопе «МЛ-2» под иммерсией (объектив х90) в затемненном помещении.
Количество АГ-позитивных клеток определяли как процент флуоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом процента флуоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля использовали препараты, подготовленные аналоі-ичньїм образом, за исключением этапа обработки клеток соответствующими МАТ. Вместо МАТ использовали в этом случае солевой раствор Хенкса.
23.