ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Схема обезвоживания и пропитывания парафином биопсийного и операционного материала

Протоколы проведения иммуногистохимических исследований, реактивы и оборудование

а) Подготовка срезов ткани, фиксированной в формалине, залитой в парафин

1.

Адгезив L- Полилизин (молекулярная масса 150 кДа) 1 мг/мл дистиллированной воды.

2. Высушивали препараты при 37°С в течение 18 час или при 56°–60°С в течение 30 мин. Во избежание повреждения антигенов срезы держали при повышенной температуре не более указанного времени.

б) Основной (sABC) протокол иммуногистохимического окрашивания парафиновых срезов

1. Срезы помещали на 30 мин в термостат при 56°C.

2. Парафин удаляли с неостывших срезов инкубацией в двух сменах ксилола.

Длительность одной инкубации 5–10 мин.

3. Срезы гидратировали в абсолютном этаноле, меняя его трижды, и помещали стекла в проточную воду.

4. Эндогенную пероксидазную активность блокировали в 0,6% растворе перекиси водорода в метаноле в течение 10 мин при постоянном встряхивании на шейкере.

5. Срезы ополаскивали в промывном буфере в течение 5 мин, используя шейкер.

6. В зависимости от исследуемых антигенов, срезы обрабатывали в скороварке или проводили протеазную обработку (в соответствии с протоколами).

7. Срезы промывали в буфере дважды по 2 мин.

8. Избыток жидкости удаляли с предметного стекла вокруг срезов при помощи салфетки и срезы обводили специальным гидрофобным карандашом. Предметные стекла укладывали горизонтально во влажной камере и наносили на каждый срез каплю 10% раствора нормальной сыворотки животного-донора вторых антител. Инкубация проходила 20 мин при комнатной температуре.

9. Избыток сыворотки удаляли со срезов с помощью салфетки.

10. Наносили раствор первичного антитела в 1% растворе БСА в рабочем разведении, которое определяли в сериях контрольных титрований. На срезы отрицательного контрольного исследования первичные антитела не наносили.

11. Инкубировали в течение ночи при 4°С.

12. Ополаскивали срезы в промывном буфере трижды по 1 мин. Излишки буфера со стекол удаляли.

13. На срезы наносили раствор вторых биотинилированных антител. Рабочее разведение антител в 1% БСА определяли заранее в сериях контрольных титрований. Инкубировали в течение 35 мин при комнатной температуре. При работе с моноклональными антителами использовали кроличьи антимышиные антитела.

14. Ополаскивали срезы в промывном буфере трижды по 1 мин. Излишки буфера со стекол удаляли.

15. На срез наносили конъюгат стрептавидина/биотинилированной пероксидазы хрена (ПХ-sABC). Инкубировали 30 мин. SABC-комплекс готовили не позднее чем за 30 мин до использования и использовали не более 3 суток.

16. Промывали срезы в буфере трижды по 3 мин.

17. Срезы инкубировали в свежеприготовленном буферном растворе 3,3'- диаминобензидинтетрахлорида (ДАБ)/H2O2. Развитие окраски следили в микроскоп: если 5-минутная инкубация не давала необходимой интенсивности окраски, продолжали инкубацию с ДАБ от 1 до 5 мин.

18. Промывали срезы водой.

19. Окрашивали ядра гематоксилином (слабо), при необходимости дифференцировали окраску в солянокислом спирте, промывали проточной водой до получения синей окраски ядер.

20. Препараты обезвоживали в спиртах и ксилоле и заключали срезы в канадский бальзам.

в) Обработка парафиновых срезов ткани, фиксированной формалином, в кастрюле-скороварке

1. Скороварку, наполненную на две трети ее объема соответствующим буфером, доводили до кипения на лабораторной электроплитке, не закрывая крышку на защелку.

2. Предметные стекла с депарафинированными срезами помещали в держатель из химически инертного материала и погружали держатель в кипящий буфер. При появлении струи пара из клапана с установленным низким уровнем давления засекали время начала обработки.

3. По истечении 4 мин скороварку быстро помещали в холодную воду и после выравнивания давления извлекали стекла из буфера.

4. Стекла промывали в воде (1–3 мин) и помещали в промывной буфер, следя за тем, чтобы срезы не высыхали.

5. Выполняли основной протокол ИГХ окрашивания с пункта 7.

6. Для реставрации большинства антигенов был оптимальным 0,01М цитратный буфер, pH 6,0. В некоторых случаях лучшие результаты давал буфер с высокими значениями (0,01М ЭДТА pH 9,0).

г) Обработка протеолитическими ферментами парафиновых срезов ткани, фиксированной формалином

1. Срезы депарафинировали; одновременно приготовляли нагретые до 37 С растворы ферментов.

2. Прогревали срезы в дистиллированной воде при 37 С в течение 10 мин.

3. Инкубировали срезы в растворе фермента в течение 5–20 мин при 37 С или при комнатной температуре. Оптимальные условия реакции подбирали в предварительной серии опытов.

4. Останавливали протеолиз, погружая стекла со срезами в проточную воду на 10 мин.

5. Следовали основному протоколу ИГХ окрашивания с п. 7 .

Трипсин: ex temporе приготовляли 0,1% (в/о) раствор CaCl2 в воде или буфере 0,05M трис-HCl, pH 7,8 и прогревали его до 37°С в термостате. До нанесения на срезы держали раствор трипсина при 37°С.

Проназа: 0,05% (в/о) рабочий раствор проназы в буфере 0,05M трис-HCl, 0,1M NaCl, pH 7,2 (TBS) при 37° С.