<<
>>

Характеристика токсичности и биологического действия фуллеренов in vivo

При исследовании фуллеренов в системах in vivoформа их введения в организм животных может оказывать значительное влияние на результат. В ранних исследованиях по токсичности фуллерена C60его перевод в водные растворы осуществляли, растворяя это вещество в тетрагидрофуране (ТГФ) с последующим разбавлением системы водой и отгонкой органического растворителя на роторном испарителе [19].

При действии таких дисперсий фуллерена на биологические системы часто наблюдались негативные эффекты. Примером может служить работа [123], в которой изучали воздействие водно­

органической дисперсии фуллерена C60на личинок окуня Micropterus salmoidus. Признаками токсического эффекта явились значительное окисление липидов в мозге, истощение пула тканевого восстановленного глутатиона, при этом гибель организмов не наблюдалась.

В настоящее время доказано, что указанная методика перевода фуллерена в водорастворимую форму является неудовлетворительной, поскольку даже при самой интенсивной отгонке растворителя определённые его количества остаются связанными в составе мультимолекулярных фуллереновых мицелл. К тому же, особенно в условиях проведения экспериментов на свету, следует учитывать реакцию генерации РСК, катализатором которой является C60, с последующим окислением ТГФ, дающим высокотоксичные производные, такие, как гидроперекись ТГФ, у-бутиролактон и тетрагидро-2-фуранол [67, 185]. Для подтверждения этого в цитируемой работе изучали in vivoв сравнительном аспекте токсичность фуллерена C60в форме чисто водной дисперсии (полученной под действием ультразвука) и в виде «раствора», полученного с применением ТГФ. Экспериментальной моделью послужили личинки аквариумной рыбки Danio rerio(зебрафиш). В результате показано, что под воздействием системы TΓΦ-C60наблюдалась значительная гибель рыбок, а у выживших была отмечена повышенная экспрессия генов ферментов, участвующих в антиоксидантной защите.

В отличие от этого, чисто водная дисперсия фуллерена C60никакого воздействия на рыбок в данных условиях не оказывала. Аналогичные результаты, свидетельствующие о высокой токсичности продуктов фотоокисления ТГФ, находящегося в прочном комплексе с фуллереном, были получены на модели дафний [151].

В работе [77]поглощение фуллеренов (гомологов от C60 до C98) личинками зебрафиш из водной дисперсии изучали с помощью стабильноизотопной метки 13C. Интенсивную абсорбцию фуллеренов рыбками наблюдали на протяжении 12 часов. Поглощенные фуллерены вызывали дозозависимую гибель рыбок, на основании чего была рассчитана LD50, которая составила 0,079 мг/кг массы тела. На основании этих данных можно сделать вывод, что фуллерены следовало бы

отнести к высоко токсичным веществам. Можно предположить, что причиной такого результата могла явиться методика перевода фуллерена в «водорастворимую» форму, для чего использовали диметилсульфоксид (ДМСО). По данным авторов работы суспензии фуллерена Сбо в ДМСО готовили добавлением 0,5 мг фуллерена к 10 мл ДМСО; полученную суспензию обрабатывали ультразвуком в течение 1 недели для достижения номинальной концентрации 0,05 мг/мл. Водные растворы для обработки гидробионтов готовили путём последовательного разведения полученных коллоидных дисперсий до нужной концентрации; в определённых случаях при приготовлении «растворов» фуллерена применяли также толуол. Очевидно, что в этих условиях определённые количества применяемых растворителей могли оказывать собственное токсическое действие на гидробионты, которое никак не контролировалось.

В исследовании [194]токсичность водных дисперсий фуллерена Сбо для зебрафиш была изучена в хроническом эксперименте. В результате длительного для данного вида организмов (96 ч) воздействия Сб0 в концентрации 1,5 мг/л наблюдали замедление развития личинок, снижение двигательной и поисковой активности, отёк перикарда. Эксперименты проводили на свету, токсическое действие фуллерена подавлялось восстановленным глутатионом, из чего сделан вывод, что механизм токсичности фуллерена, по-видимому, состоит в фотоиндуцированном образовании РСК, вызывающих in vivoкаскад реакций перекисного окисления.

В отличие от немодифицированного фуллерена Сб0, его полигидроксилированное производное было не токсично. Как показали [1б5, 1бб] при обработке личинок зебрафиш фуллереном Сб0 в темноте смертность снижалась на 30%, уродства на 40%, а перикардиальный отек на 85% по сравнению с аналогичным воздействием при освещении. При повышении уровня внутриклеточных антиоксидантов (восстановленного глутатиона) токсичность также снижалась. Инкубация личинок с глутатионом не изменяла токсичности, возможно, ввиду отсутствия проникновения трипептида в клетки, однако инкубация с N-ацетилцистеином привела к снижению смертности на 30%,

перикардиального отека на 50%. Инкубация с аскорбиновой кислотой также вызывала снижение токсичности. Воздействие совместно с бутадионином - сульфоксимином и диэтилмалеатом (ингибиторы синтеза глутатиона) приводило к резкому повышению токсичности фуллерена С60. Аналогичные результаты были получены [193, 192], которые выявили наличие фотоиндуцированной токсичности фуллерена С60 для пресноводного карася. Полученные результаты наглядно иллюстрируют то положение, что фотоиндуцированная токсичность С60 опосредуется свободнорадикальными процессами перекисного окисления, механизм защиты от которых реализуется при участии системы восстановленного глутатиона (возможно, посредством действия глутатионпероксидазы).

В работах [100, 191, 90]сообщается о токсичности обработанных ТГФ и ультразвуком водных дисперсий фуллерена для дафний. При этом авторы исследования [100]не наблюдали выраженного дозозависимого эффекта (наиболее токсичными были растворы низкой концентрации).

Токсичность распределенных в воде мультимолекулярных частиц фуллерена для личинок рыбы Fundulus heteroclitusисследована в статье [33]. При воздействии на эмбрионы и взрослых особей, в возрастающих концентрациях водной дисперсии агрегированных наночастиц фуллерена С60 (наноC6о), смертность организмов отмечалась в очень малой степени, вследствие чего LD50 не может быть точно рассчитана; её величина, во всяком случае, превышала 10 мг/л в расчёте на фуллерен С60.

Агрегаты rnroC60 скапливались у хориона, но не влияли на развитие эмбрионов или успешность процесса их выведения из икринок. Таким образом, наново практически не обладал эмбриотоксичностью в отношении Fundulus heteroclitus.

Немодифицированные фуллерены обладали эмбриотоксическим эффектом у мышей согласно данным [161]. В отличие от этого, в работе [89]эмбриотоксическое действие чисто водной дисперсии фуллерена С60 (но не его дисперсии, полученной с использованием толуола) не было подтверждено на модели эмбрионов рыбы Oryzias latipes.Среди особенностей цитируемой работы следует указать на то, что авторами исследовалось влияние на токсические

свойства водных дисперсий различных углеродных наноматериалов (фуллеренов, многослойных нанотрубок) органического вещества донных отложений, что важно для оценки экотоксичности при реальных сценариях воздействия на гидробионты в природных условиях. Применительно к водной дисперсии фуллерена C60никакого влияния на его эмбриотоксические свойства органические вещества донных отложений не оказывали, тогда как в случае дисперсий, полученных с использованием толуола, отмечалось выраженное снижение интенсивности выявляемых эффектов.

В работе [90]не наблюдали гибели Daphnia rulex,подвергнутых воздействию водных дисперсий мультимолекулярных частиц фуллерена C60, но отмечали повышение активности каталазы и глутатион^-трансферазы в организме рачков, что свидетельствовало об известном «перенапряжении» функционирования системы антиоксидантной защиты.

Авторы работы [40]исследовали возможные последствия воздействия различных наночастиц, в том числе фуллеренов, в естественных условиях на мидий. Мидий подвергали воздействию различной концентрации (0,05-0,2-1-5 мг/л) суспензий наночастиц в течение 24 часов, после чего различные биомаркеры были оценены в гемоцитах, пищеварительных железах и жабрах. В пищеварительной железе все виды наночастиц индуцировали лизосомальное накопление липофусцина только при высоких концентрациях в различной степени в зависимости от типа тестируемых наночастиц.

В отличие от наночастиц серебра, TiO2 и SiO2, фуллерены не индуцировали накопление нейтральных лизосомальных липидов. По остальным параметрам токсического действия наночастицы фуллерена занимали, как правило, промежуточное положение между наиболее токсичными наночастицами серебра и относительно менее токсичными оксидными наночастицами. В целом, эти данные показывают, что беспозвоночные-фильтраторы являются значимой мишенью для наночастиц в водной среде.

Как показано [38]фуллеренол C60(OH)24 защищает мышей от ионизирующего излучения, индуцирующего иммунную и митохондриальную

дисфункцию. В этих исследованиях мышам предварительно вводили внутрибрюшинно раствор фуллеренола Сбо(ОН)24 в течение 2 недель (ежедневно, в дозе 40 мг/кг массы тела), затем подвергали облучению всего тела смертельной дозой гамма-облучения (от источника б0Со). Выживание наблюдали в течение 30 дней после облучения. Было установлено, что введение Сбо(ОН)24 перед ионизирующим облучением фактически спасает организм от его детерминированных эффектов без какой-либо видимой токсичности в данной дозе. Предварительная обработка животных фуллеренолом Сбо(ОН)24 в более высоких дозах, вызывающих снижение иммунной функции и функции митохондрий, также показала значительный защитный эффект от ионизирующего излучения. Эти результаты показывают, что полигидроксилированные производные фуллерена являются эффективными радиопротекторами, что совпадает по существу с данными работ, представленных в обзоре [б3].

В работе [144]изучали действие фуллерена Сбо и фуллеренола на лёгкие крысы in vivoпри интрарахеальном введении. Изучаемыми показателями были содержание клеток, окислителей и глутатиона в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ), клеточная пролиферация и гистопатологическое исследование лёгких через 1 день, 1 и 3 месяца после введения предполагаемых токсикантов. В результате показано, что как фуллерен, так и фуллеренол оказывали только транзиторное воспалительное действие, в то время как для контрольного образца - НЧ кристаллического SiO2(кварца) отмечался выраженный стойкий токсический эффект по всем изучаемым показателям.

Авторы исследования [108]изучали in vivoв легких крыс воспалительные реакции и экспрессию генов цитокин-индуцированных факторов хемотаксиса нейтрофилов HNP -1, -2αβ и -3, после ингаляционных воздействий

немодифицированного фуллерена Сбо. Использовали наноразмерные дисперсии, стабилизированные путем измельчения в агитационной мельнице в среде азота, после чего проводили исследования при интратрахеальных инстилляциях и ингаляционном воздействии. В первом случае фуллерены диспергировали в дистиллированной воде содержащей 0,1% Твин 80, диаметр агрегатов фуллеренов

составил 33 нм. Полученные суспензии вводили интратрахеально крысам самцам линии Вистар в дозах 0,1 мг, 0,2 мг, или 1 мг, после чего их забивали через 3 дня, 1 неделю, 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев. Во втором случае, при исследовании ингаляционного воздействия крыс подвергали воздействию агрегатов фуллерена диаметром 96±5 нм в концентрации 0,12±0,03 мг/м3 на протяжении 6 часов в сутки, по 5 сут в неделю, в течение 4 недель, после чего их умерщвляли через 3 сут, 1 и 3 мес по окончании экспозиции. В результате, после интратрахеальных инстилляций в дозе 0,1 и 0,2 мг, в легких крыс не было выявлено значительного увеличения общего числа клеток и нейтрофилов в БАЛ, а также отсутствовала экспрессия генов HNP-1, -2αβ и -3. Однако, в группе, получавшей фуллерен в высокой дозе (1 мг), было обнаружено временное значительное увеличение содержания нейтрофилов и экспрессия генов HNP-1, -2αβ и -3. При

ингаляционном воздействии не было выявлено изменений в изучаемых показателях во всех применявшихся концентрациях. Авторы предположили, что хорошо диспергированные немодифицированные фуллерены не обладают значительным потенциалом активации нейтрофильного воспаления в легких.

В работе [28]изучали ингаляционную токсичность фуллерена С60 для крыс в форме мультимолекулярных НЧ (диаметром 55 нм) или микрочастиц (930 нм). Ингаляцию проводили на протяжении 10 сут по 3 ч в сут в концентрации 2,2-2,3 мг/м3. Исследование БАЛ от животных, экспонированных фуллеренами, продемонстрировало накопление углеродистого материала в вакуолях макрофагов, которое было более выраженным под воздействием НЧ, чем микрочастиц. С другой стороны, биохимические показатели, характеризующие токсичность, изменялись у животных опытной группы незначительно, что дало основание авторам сделать вывод о низкой ингаляционной токсичности фуллерена.

В отличие от данных, полученных в предыдущих экспериментах по изучению ингаляционной токсичности, результаты работы [127]показали, что фуллерены C60могут вызывать воспалительные реакции в легких мышей. В результате ингаляции, фуллерен C60 индуцировал увеличение числа клеток в

фазах митоза subG1 и G1 в клетках БАЛ. Было отмечено увеличение выработки противоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1, фактор некроза опухоли-а и ИЛ-6, и увеличение Th1 цитокинов, таких как ИЛ-12 и IFN-γ. Кроме того, уровень IgE достигал максимума через день после экспозиции как в БАЛ, так и в крови. Экспрессия генов молекул MHC класса II (H2-Eb1) под действием C60была сильнее, чем у молекул класса MHC I (H2-T23). Кроме того, во время эксперимента постоянно наблюдалась клеточная инфильтрация и экспрессия генов, связанных с поврежденными тканями легких. Исходя из этого, считают, что ингалируемый фуллерен C60может вызвать воспалительные реакции в легких мышей.

Внутрибрюшинное введение мышам и крысам суспензии мультимолекулярных частиц фуллерена диаметром менее 2 микрон в очень высокой дозе (2,5 г/кг) не приводило к гибели животных и изменениям в их поведении на протяжении 8 недель [58, 115]. После забоя животных,

подвергнутых воздействию, в их внутренних органах не было выявлено характерных для токсического действия морфологических изменений. Частицы фуллерена активно захватывались селезёнкой, а также Купферовскими макрофагами, гепатоцитами и адипоцитами печени. Выявленная у мышей (но не у крыс) гипертрофия этих клеток, обусловленная их абсорбирующей активностью, не сказывалась, однако, на морфологии органов в целом. В исследовании [115]не выявлено некроза и других признаков повреждения гепатоцитов при парентеральном введении фуллерена животным.

В работе [164]определяли острую токсичность фуллеренола для мышей при внутрибрюшинном введении. Значение LD50составило 1,2 г/кг. Введение фуллеренола в сублетальных дозах от 0,5 до 1,0 г/кг снижало содержание цитохромов Р450 и b5, а также активности НАДФН-цитохром-Р450-редуктазы, бенз[а]пирен гидроксилазы, 7-этоксикумарин-О-дитилазы, анилингидроксилазы и эритромицин-№-деметилазы в микросомах печени. Введение фуллеренола в дозах от 0,01 до 0,1 г/кг не оказывало никаких эффектов на эти монооксигеназы.

Водорастворимые полиарилсульфированные фуллерены были способны вызывать фаголизосомальную форму нефропатии у крыс после однократной внутрибрюшинной инъекции в дозе 500 мг/кг или внутривенно в дозе 100 мг/кг. Ультраструктурное исследование показало многочисленные мембранные конгломераты, характерные фаголизосомальные и/или лизосомальные включения в цитоплазме клеток эпителия почечных канальцев. При внутрибрюшинном и внутривенном, но не пероральном введении было отмечено также поражение печени [45].

Достаточно велико число работ, в которых на различных моделях было показано практическое отсутствие у фуллеренов токсических свойств in vivo.Так, авторами исследования [8]проводилась оценка генотоксичности фуллерена Сбо для личинок мухи Drosophila melanogaster.При концентрации фуллерена до 0,45 мкг/мл культурального субстрата он не вызывал каких-либо изменений в частоте мутаций, слабый эффект был выявлен только при максимально возможной концентрации 2,24 мкг/мл. В работе [120]изучали активность орнитин­декарбоксилазы и скорость синтеза ДНК в эпидермисе мыши после 72-часового накожного нанесения фуллерена Сбо в виде раствора в бензоле в общей дозе 0,2 мг. В результате каких-либо значимых эффектов выявлено не было. Хронические исследования, проведённые на данной модели, показали, что фуллерен не вызывает у животных опухоли кожи. Нанесение фуллерена на кожу мышей в виде раствора в толуоле в течение 20 недель в условиях освещения также не приводило к образованию опухолей [107]. Наблюдавшаяся в месте воздействия препарата эритема может быть объяснена действием растворителя.

Большое количество исследований, опубликованных в недавнем обзоре [179]было направлено на изучение у фуллеренов в условиях in vivo антиоксидантых свойств. Обзору ранних работ в этом направлении посвящена статья [23], в которой обобщены результаты тестирования дисперсии фуллерена в различных системах in vivo.В диапазоне концентраций от 10-9 до 10-4 моль/л и суммарной дозе до 25 мг/кг фуллерен не проявлял каких-либо токсических свойств, но демонстрировал выраженное антиоксидантное действие. В настоящее

время антиоксидантные свойства изучаются преимущественно для дериватизированных фуллеренов, растворимость которых в воде позволяет вводить их в значимых количествах в биологические объекты. Так, сообщается о наличии антиоксидантных свойств у аддукта фуллерена С60 с в-аланином [70]и цистеином [69].

Что же касается антиоксидантных свойств водорастворимого фуллеронола С60(ОН)24[159], то они были изучены при воздействии данного соединения на организм крыс, причём установлено также выраженное радиопротекторное действие в отношении внешнего рентгеновского облучения, что было подтверждено гистологическими и гематологическими данными. Согласно [98]фуллеренол предотвращает развитие вызванного ионами Fe(II) перекисного окисления липидов в мозге крыс. Перекисное окисление в мозге крыс, вызванное действием перекиси водорода или перекиси кумола, могло быть блокировано фуллеренолом [160]. Для модифицированного разветвленными боковыми алифатическими цепями, несущими 18 карбоксильных остатков производного фуллерена (дендрофуллерен, ДФ1), показано выраженное радиопротекторное действие в отношении личинок зебрафиш [34], что согласуется с результатами исследования [158], где также была изучена способность ДФ-1 защищать чувствительные к облучению клетки от эффектов высоких доз гамма излучения. Были подтверждены данные об отсутствии токсичности в клетках при использовании ДФ-1, притом, что ДФ-1 защищал лимфоциты человека и кишечные крипты клеток крыс от радиационно-индуцированной гибели клеток.

Авторы большинства исследований сходятся во мнении о том, что перевод фуллеренов в гидрофильные, водорастворимые формы, например, путём их гидроксилирования, значительно снижает их токсичность. Так, в исследовании in vivoна крысах, получавших интратрахеальные инстилляции фуллерена и фуллеренолов в сопоставимых дозах от 0,2 до 3,0 мг/кг [143]установлено, что перевод фуллеренов в высокорастворимые производные снижает их токсичность в 7 и более раз. По данным [19] LD50для фуллеренола при внутрибрюшинном введении мышам составила 1,2 г/кг массы тела, что сравнимо с величиной для

такого считающегося малоопасным соединения, как хлористый натрий. В работе [17б] водорастворимое производное фуллерена Сбо не вызывало гибели мышей в течение 1 недели после его парентерального введения в дозе до 500 мг/кг. Аналогично, в работе [1]показано отсутствие токсического действия аддукта фуллерена с аминокислотой серином при парентеральном введении мышам. Для фуллеренкарбоновых кислот, производных фуллеренов Сбо и С70 не выявлено цитотоксичности в отношении В-лимфоцитов и изменений в дофаминергической системе чёрной субстанции при введении непосредственно в мозг [7б].

Авторы работы [44]отмечают высокую эффективность гидроксилированного соединения включения C82(OH)22@Gd как противоракового средства, притом, что данное соединение обладает низкой токсичностью. На механизм этого эффекта проливают свет результаты работы [99], где в системах in vitroи in vivoданный металлофуллеренол был охарактеризован как иммуномодулятор, вызывающий сдвиг Т-клеточного ответа в сторону повышения функциональной активности T∣11 клеток, что выражалось в увеличении продукции лимфоцитами цитокинов TNF-α, IFN-γ и ИЛ-2 и снижении - ИЛ-4,5,б. Значительный объём данных о перспективах использования металлосодержащих соединений включения на основе фуллеренолов в качестве противоопухолевых средств приведён в работе [180]. Аналогично сообщается об использовании фотодинамических свойств химически модифицированных фуллеренов для уничтожения раковых клеток [117]и клеток, инфицированных вирусами [20].

В единственном исследовании [2б] была охарактеризована острая, подострая и субхроническая токсичность фуллерена Сб0 при пероральном пути поступления. Внутрижелудочное зондовое введение фуллерена Сбо, диспергированного в оливковом масле, осуществляли в дозе 1,7 мг/кг ежедневно в течение недели, затем раз в неделю до конца второго месяца и далее каждые две недели до конца 7-го месяца. При этом не только не выявлено признаков токсичности, но и отмечено продление жизни животных, подвергнутых экспериментальной интоксикации CCl4на фоне введения фуллерена Сб0. Авторы предполагают, что влияние на продолжительность жизни в основном связано с

ингибированием под действием фуллерена ассоциированного с возрастом окислительного стресса.

Подводя итог вышеизложенному, необходимо отметить, что объем исследований, проведенных в условиях in vivoне позволяет сделать выводы о безопасности воздействия фуллеренов и их многочисленных разнообразных производных на живые организмы, во-первых, ввиду противоречивости полученных данных. Во-вторых, недостаточно количество работ, в которых охарактеризованы эффекты, связанные с поступлением фуллеренов при естественном (пероральном) пути поступления, в том числе в течение длительного времени, в подострых, субхронических и хронических экспериментах в широком интервале доз. Необходимо также учитывать недостаточно изученные эффекты возможного потенцирования фуллеренами токсичности различных ксенобиотиков [31]. Всё это позволяет заключить, что проблема токсикологической оценки фуллеренов in vivo,в условиях, приближенных к сценариям естественной экспозиции человека этими соединениями (с пищей, водой, вдыхаемым воздухом, косметическими и лекарственными средствами) в настоящее время далека от разрешения.

2.4

<< | >>
Источник: ШИПЕЛИН ВЛАДИМИР АЛЕКСАНДРОВИЧ. ИЗУЧЕНИЕ ТКАНЕВОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ФУЛЛЕРЕНОВ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ИХ ТОКСИКОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Москва - 2014. 2014

Еще по теме Характеристика токсичности и биологического действия фуллеренов in vivo:

  1. Изучение амилоидогенеза in vitro: значение для разработки диагностики и терапии амилоидозов
  2. ОГЛАВЛЕНИЕ
  3. Характеристика токсичности и биологического действия фуллеренов в экспериментах in vitroи in silico
  4. Характеристика токсичности и биологического действия фуллеренов in vivo
  5. Изучение биораспределения и метаболизма фуллеренов в экспериментах in vivo
  6. Краткое заключение
  7. 8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Акушерство и гинекология - Анатомия - Андрология - Биология - Болезни уха, горла и носа - Валеология - Ветеринария - Внутренние болезни - Военно-полевая медицина - Восстановительная медицина - Гастроэнтерология и гепатология - Гематология - Геронтология, гериатрия - Гигиена и санэпидконтроль - Дерматология - Диетология - Здравоохранение - Иммунология и аллергология - Интенсивная терапия, анестезиология и реанимация - Инфекционные заболевания - Информационные технологии в медицине - История медицины - Кардиология - Клинические методы диагностики - Кожные и венерические болезни - Комплементарная медицина - Лучевая диагностика, лучевая терапия - Маммология - Медицина катастроф - Медицинская паразитология - Медицинская этика - Медицинские приборы - Медицинское право - Наследственные болезни - Неврология и нейрохирургия - Нефрология - Онкология - Организация системы здравоохранения - Оториноларингология - Офтальмология - Патофизиология - Педиатрия - Приборы медицинского назначения - Психиатрия - Психология - Пульмонология - Стоматология - Судебная медицина - Токсикология - Травматология - Фармакология и фармацевтика - Физиология - Фтизиатрия - Хирургия - Эмбриология и гистология - Эпидемиология -